<div align="justify"> O termo optogenética refere-se a técnicas que combinam luz (ótica), genética e bioengenharia e permitem o estudo de circuitos neuronais e comportamentos atuando em células específicas. O termo “optogenética” (do inglês “optogenetics”) deve-se, etimologicamente, à combinação de “opto-“, que refere o uso de feixes de luz ou lasers, com “genética”, que se deve ao uso de genes de opsinas e de genes que restringem o processo a células específicas. Este termo foi usado pela primeira vez por um grupo de investigação da Universidade de Stanford liderado por Karl Deisseroth, em 2005, para designar esta técnica que possibilita o controlo de neurónios geneticamente modificados através de métodos óticos.Deisseroth, K., et al., Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits. J Neurosci, 2006. 26(41): p. 10380-6.
Através da expressão génica de canais ativados por luz a comprimentos de onda específicos é possível controlar, com uma precisão de milissegundos, a ativação de células específicas.Fenno, L., O. Yizhar, e K. Deisseroth, The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci, 2011. 34: p. 389-412.Plaiasu, V., Update in Genetics. Maedica (Buchar), 2011. 6(1): p. 70. A optogenética permite, assim, analisar em animais vivos neurónios marcados seguindo e controlando os seus eventos elétricos e bioquímicos, modulando comportamentos.
Tal como se tem verificado nos últimos anos, a possibilidade de ativar e/ou silenciar neurónios específicos poderá contribuir muito significativamente para entender como estão definidos os circuitos neuronais em condições normais e patológicas.Wentz, C.T., et al., A wirelessly powered and controlled device for optical neural control of freely-behaving animals. J Neural Eng, 2011. 8(4): p. 046021. Além de neurónios, é também possível estudar, através desta técnica, células da glia, musculares, cardíacas e células estaminais embrionárias, o que potencia o futuro uso desta técnica em diversas terapias como doença de Parkinson, depressão ou cegueira.
História e evolução As primeiras técnicas de optogenética eram bastante diferentes daquelas conhecidas por este termo nos dias de hoje, tendo surgido, inicialmente, como simples processos de fluorescência. Apenas muito recentemente se deu início ao uso de rodopsinas para controlar atividade celular por meio de luz e com comprimentos de onda específicos. Sendo que nos últimos anos a optogenética sofreu melhorias significativas, ganhando uma resolução espaciotemporal elevadíssima e permitindo o controlo remoto de comportamentos. Uma cronologia dos acontecimentos mais importantes que contribuíram para o surgimento da optogenética como a conhecemos hoje é apresentada abaixo. 800px|centro As primeiras técnicas miniaturadaimagem|direita|Medusa fluorescente. O fenómeno da fluorescência foi descrito pela primeira vez na segunda metade do século XVI, aquando da mistura de 3 tipos diferentes de madeira numa solução aquosa que levaria a uma reação de produção de um composto fluorescente denominado “matlaline”. Desde essa altura, a fluorescência começou a ser manipulada por cientistas, mas apenas em meados dos anos 90 este fenómeno natural começou a ser combinado com a engenharia genética. Conjugando microscopia ótica com moléculas marcadas por moléculas que emitem luz, foi possível estudar onde determinada molécula era sintetizada na célula e/ou segui-la até aos seus alvos. Esta técnica permite medir as concentrações de cálcio intracelulares como sensores de variações intracelulares.
Aequorina Aequorina foi a primeira proteína fluorescente a ser purificada, em 1962 por Osamu Shimomura da medusa Aequorea.Shimomura, O., F.H. Johnson, e Y. Saiga, Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol, 1962. 59: p. 223-39. Esta molécula tem a capacidade de emitir luz azul (469 nm) quando o cálcio se liga a determinados locais de ligação. Tornou-se uma ferramenta generalizada de deteção de cálcio intracelular de forma rápida, mas inicialmente tinha que ser injetada.Shimomura, O., F.H. Johnson, e Y. Saiga, Microdetermination of Calcium by Aequorin Luminescence. Science, 1963. 140(3573): p. 1339-40. Em 1985, a aequorina foi clonada pela primeira vez e a sequência de ADN do seu gene sequenciada: a partir desse momento, a aequorina pôde ser utilizada como uma ferramenta optogenética, através da inserção do seu gene no genoma de um modelo animal ou celular, passando as células a produzir a seu própria aequorina.Inouye, S., et al., Cloning e sequence analysis of cDNA for the luminescent protein aequorin. Proc Natl Acad Sci U S A, 1985. 82(10): p. 3154-8.
Seja microinjectada ou clonada, a aequorina precisa de uma enzima designada coelenterazina que é consumido durante o processo de fluorescência e, por conseguinte, tem de ser continuamente adicionada ao meio de cultura. Esta exigência torna-a inadequada para uso direto em modelos animais complexos.
Proteína Verde Fluorescente Em 1962, Osamu Shimomura purificou uma outra proteína que também existia naturalmente em Aequorea e que absorve a luz azul da aequorina para emitir luz verde, surgindo assim a proteína verde fluorescente (PVF ou GFP do inglês "Green Fluroscent Protein"). Esta proteína verde fluorescente tornou-se uma potencial ferramenta de investigação após a sua clonagem e sequenciamento em 1992 por Douglas Prasher. Dois anos mais tarde, o laboratório de Martin Chalfie conseguiu expressar uma versão ligeiramente modificada do gene em E. coli e C. elegans Chalfie, M., et al., Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science, 1994. 263(5148): p. 802-5. e, imediatamente, definiu esta molécula como uma ferramenta in vivo para monitorizar a expressão genética e localização de proteínas. A GFP tinha as vantagens de trabalhar de forma independente de cofatores ou substratos além de ser totalmente funcional a temperatura ambiente.
No entanto, a proteína verde fluorescente tinha algumas desvantagens, como o facto de ter um espetro de emissão com dois picos e uma baixa luminosidade geral. Assim, ao longo dos anos, os investigadores desenvolveram uma série de derivados de GFP, o primeiro dos quais foi obtido, em 1995 por Roger Tsien, por um único ponto de mutação.Heim, R., A.B. Cubitt, e R.Y. Tsien, Improved green fluorescence. Nature, 1995. 373(6516): p. 663-4. Com o objetivo de utilizar várias proteínas fluorescentes ao mesmo tempo, foram necessárias mutações de cor, e assim, os investigadores criaram proteínas fluorescentes azuis, ciano e amarelo. Em 1999, Mikhail Matz criou a primeira proteína fluorescente vermelha a que chamou DsRed.Matz, M.V., et al., Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nat Biotechnol, 1999. 17(10): p. 969-73. O seu uso foi limitado porque era um tetrâmero obrigatório; mas esta restrição foi quebrada em 2002 por Roger Tsien, que usou com sucesso uma DsRed monomérica.Campbell, R.E., et al., A monomeric red fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(12): p. 7877-82.
miniaturadaimagem|direita|Mecanismo do FRET.
A fim de superar as limitações da Aequorina em imagiologia por cálcio, Roger Tsien projetou também Cameleonem 1999.Miyawaki, A., et al., Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999. 96(5): p. 2135-40. Esta construção combina uma proteína fluorescente azul e uma proteína fluorescente verde separadas por um elemento de calmodulina. Na presença de cálcio, a proteína calmodulina sofre uma alteração conformacional, juntando as duas proteínas e permitindo que ressoem (técnica de transferência ressonante de energia por fluorescência - FRET) do menor para o maior comprimento de onda da GFP mutante. Por conseguinte, é possível a utilização de diferentes combinações de mutantes de GFP, contanto que elas possam entrar em ressonância. 2002 foi também o ano da criação de outro derivado de GFP que precisava de fotoativação antes de florescer.Patterson, G.H. e J. Lippincott-Schwartz, A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science, 2002. 297(5588): p. 1873-7. Isto tornou possível ativar seletivamente moléculas de GFP dentro de uma célula, permitindo um maior nível de precisão no rastreamento de proteínas e novos usos inovadores de GFP.
GFP tem sido o método preferido no monitoramento da expressão génica e no rastreamento de proteínas desde 1994 pela sua facilidade de uso e sua grande flexibilidade, podendo também ser combinado com FRET.
Sensores optogenéticos Os sensores optogenéticos, como o Cameleon, são moléculas cujas propriedades se alteram em resposta a atividade neuronal quando há alterações no potencial de membrana nos neurónios pós-sinápticos. Os sensores tradicionais ser indicadores iónicos sensíveis a concentrações intracelulares de cálcio ou cloro, pois os potenciais de ação estão, geralmente, associados a abertura de canais de cálcio e aumento da sua concentração intracelular ou a uma diminuição da concentração de cloro. Atualmente existem sensores optogenéticos que permitem a análise da atividade neuronal através de sondas florescentes que detetam alterações temporárias no potencial de membrana quando ocorrem sinapses. Controlo de potenciais de ação com luz Os primeiros anos da optogenética focaram-se em monitorizar e observar, mas já em 1979 Francis Crick sugeriu que que a luz deveria ser usada não só para observar mas também para controlar e manipular a atividade celular, e que deveria ser desenvolvida “um método pelo qual todos os neurónios de um único tipo poderiam ser inativados, deixando os outros inalterados”. Anos mais tarde, afirmou mesmo que deveria ser criada uma técnica que usasse luz e atuasse em neurónios geneticamente alterados para responder a comprimentos de onda específicos.Crick, F.H., Thinking about the brain. Sci Am, 1979. 241(3): p. 219-32.Através do estudo de fenómenos de dispersão de luz e fluorescência associada a potenciais de ação, surgiram as primeiras ideias de usar métodos óticos para controlar atividade neuronal. Sendo que por volta de 1970 se introduziu pela primeira vez moléculas sensíveis a voltagem em membranas de neurónios. Avanços recentes Na última década, tem havido avanços significativos no desenvolvimento das técnicas de optogenética que fazem uso de ferramentas moleculares e de atuadores sensíveis a luz e restringidos a neurónios geneticamente alterados. A evolução dessas metodologias ocorreu, essencialmente, a partir de ligandos fotoconversíveis que podem ser usados para modular oticamente a atividade neuronal através da ativação de proteínas de recetores específicos.Dugue, G.P., W. Akemann, e T. Knopfel, A comprehensive concept of optogenetics. Prog Brain Res, 2012. 196: p. 1-28. O desenvolvimento das técnicas de optogenética que fazem uso desta abordagem é descrito a seguir.
Primeiras abordagens: fotoestimulação seletiva de neurónios através de chARGe Em 2002, um grupo de investigação liderado por Gero Miesenböck conseguiu fotoestimular neurónios de mamíferos de forma seletiva através de uma técnica que designou como “chARGe”. O nome da técnica tem em conta a coexpressão seletiva de genes que codificam para um canal fotoestimulável (“ch-“ do inglês “channel”) formado com 3 proteínas: Arrestina-2, importante para a desativação da rodopsina; Rodopsina presente em moscas da fruta (Drosophila Melanogaster) sensível a luz azul e a subunidade α de um heterodímero de proteína G.Zemelman, B.V., et al., Selective photostimulation of genetically chARGed neurons. Neuron, 2002. 33(1): p. 15-22. Através da expressão destes componentes, foi possível reconstituir uma cascata de fototransdução em que, após excitada e através de proteínas G, a rodopsina sinaliza uma proteína atuadora endógena (fosfolipase C) que, por sua vez, ativa canais catiónicos de forma não específica levando a despolarização.