miniaturadaimagem|397x397px|O código de barras de DNA consiste em um conjunto de técnicas para a identificação rápida e prática de espécies. No esquema, de maneira simplificada o processo de identificação: Extração do DNA do espécime em questão, seguida por técnicas de amplificação e sequenciamento e a posterior análise nos bancos de dados de códigos de barras de DNA para a comparação e identificação da espécie. A expressão Códigos de barra de DNA ou DNA Barcoding surgiu da ideia do código de barras comum, utilizado para identificação de produtos em todo o comércio, varejista ou atacadista. O método consiste em isolar sequências curtas de DNA, amplificar pelo PCR e sequenciá-las para que possam ser utilizadas na distinção e identificação de espécies. Também chamados “códigos da vida”, baseiam-se em sequências de 500 a 800 pares de bases padronizados, ou seja, presentes em um mesmo trecho do genoma. Estas sequências podem ser utilizadas para identificar organismos a partir da diversidade genética/nucleotídica existente entre eles dentro de regiões específicas do DNA e sua efetividade depende da existência de uma lacuna ou distância entre variações intraespecíficas e interespecíficas, de modo que divergências de um código de barras de DNA dentro de uma espécie (variações intraespecíficas) devam ser menores que entre espécies diferentes (variações interespecíficas), o chamado “barcoding gap”.Hebert PDN, Ratnasingham S. and deWaard JR .Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proc. R. Soc. Lond. B (Suppl.) 270, S96–S99 (2003)
Introdução Esse código pode ser visto em todas as células e constitui uma rápida e eficaz ferramenta taxonômica.DNA vira ‘código de barras da vida’ em rede de pesquisa sobre espécies (http://www5.usp.br/40054/rede-de-pesquisa-usa-dna-como-codigo-de-barras-para-identificar-especies/) que agrega apoio molecular à sistemática, “etiquetando” as sequências de DNA já catalogadas,auxiliando no entendimento do processo evolutivo, otimizando a identificação de amostras, acelerando processos de registros de descoberta de novas espécies (HERBERT et. al., 2003) e validando, com base no sequenciamento do DNA, a variabilidade e a classificação de organismos, sejam estes seres viventes na atualidade ou até fósseis de vegetais e animais já extintos. O Código de Barras do DNA é aplicável, também, na Biologia da Conservação por ser uma ferramenta facilitadora para gerenciar a biodiversidade (RUBINOFF, 2006).
Histórico
Muito antes do surgimento do Código de Barras do DNA, a identificação de uma espécie era realizada a partir da observação fenotípica de caracteres anatômicos e morfológicos. A partir das informações fornecidas pelo Projeto Genoma, o perfil genético também foi considerado, reclassificando muitas espécies, desde gênero até reino. Contudo, existem espécies muito semelhantes fenotipicamente e discrepantes geneticamente, pela interação com diferentes ambientes que pode modificar a manifestação gênica por adaptação ou outras, morfologicamente diversas mas com determinados genes muito semelhantes (MANCEAU et. al., 2010).
O sistema de identificação molecular por código de barras genético, único para cada espécie, é semelhante ao código de barras universal de produtos utilizado no mercado varejista: emprega 10 números alternados em 11 posições para gerar 100 bilhões de identificadores únicos. Foi proposto por Paul Hebert e seus colaboradores, em 2003. como uma ferramenta de apoio molecular à sistemática, a técnica do Código de Barras do DNA (DNA barcoding) tomou como base a sequência do gene COI (subunidade I da Citocromo Oxidase), localizado no DNA mitocondrial. A ideia é utilizar uma pequena sequência genética de uma determinada parte do genoma na discriminação de espécies, da mesma forma que um scanner de supermercado distingue produtos usando as listras pretas do Código Universal de produtos. É considerado um sistema bio identificador, sendo possível também utilizar o DNA nuclear e o DNA de cloroplastos no processo.miniaturadaimagem|425x425px|Comparação da sequência do código de barras e da sequência de nucleotídeos (respectivamente) de uma mariposa.O DNA _mitocondrial é utilizado para amostras animais. Para plantas e organismos dotados de cloroplasto utiliza-se o DNA contido neste, especialmente por seu alto número de cópias de nucleotídeos (BARCODE OF LIFE, 2010-2015). O DNA nuclear é utilizado em eucariotos em geral, por armazenar genes com maior variabilidade (FARAH, 2007). Não é recomendado o uso de DNA _nuclear na identificação de famílias multigênicas pela possibilidade de apresentarem pseudogenes, não expressos, similares aos genes funcionais mas que, seja por vários episódios de duplicação no processo evolutivo, por se localizarem em diferentes habitats e/ou por terem sofrido mutações podem indicar falso resultado.
Técnica miniaturadaimagem|262x262px|A variação dentro de uma espécie (intraespecífica) do DNA mitocondrial é muito menor do que entre espécies (interespecífica). Existe uma distância (um GAP), que indica um processo de especiação. As técnicas que originaram o desenvolvimento do código de barras de DNA foram idealizadas quando o sequenciamento de DNA microbiano, mais especificamente o gene 5S RNAr, estava sendo estudado. Estas pesquisas se aprofundaram no início dos anos 2000 e, baseadas no estudo de Folmer et al, de 1994, utilizando a premissa da variabilidade uma região específica do gene da Citocromo C oxidase (COI) para distinguir táxons, foi criado o código de barras de DNA, um sistema unificado de bioidentificção. Essas técnicas permitiram, a partir da utilização de um recorte de um (ou mais) genes de uma sequência de DNA de um organismo, identificar toda uma espécie, posto que as variações intraespecíficas são muito menos comuns do que aquelas interespecíficas (entre espécies), com grande variação num locus específico (barcode_gap).
Para cada espécie, um código de barras de DNA exclusivo é gerado. Com isso, criou-se um inventário, que, aliado à taxonomia convencional, refina a classificação de espécies, especialmente aquelas limítrofes.
Atualmente, o código de barras de DNA utiliza regiões específicas para cada grupo de organismos, a partir de uma seleção de marcadores específicos: extrai-se o DNA daquela região peculiar da amostra, que é isolada e replicada por amplificação, por PCR (reação em cadeia da polimerase), obtendo-se o sequenciamento dos nucleotideos. Eventuais inibidores presentes na sequência devem ser excluídos para maximizar sua qualidade. Após essas técnicas de sequenciamento e amplificação serem realizadas, o resultado é posteriormente comparado com o banco de dados disponível para a seguinte identificação. A seguir, resumidamente, descrições sobre a aplicação em diferentes organismos (mais detalhados no tópico: Códigos de Barra de DNA).miniaturadaimagem|211x211px|Genoma mitocondrial - destaque para a região do gene Citocromo oxidase, onde está presente o COI.
Para animais é utilizada uma parte do gene COI localizada no DNA mitocondrial - numa mesma amostra é possível coletar várias mitocôndrias - o DNAm é haplóide e muito mais preciso do que o DNA nuclear (DNAn).
Para fungos,o ITS, do RNA ribossômico vem sendo utilizado juntamente com o COI, uma vez que esta combinação de primers é mais efetiva para este grupo.
Em plantas terrestres, são usados códigos de barras de pelo menos duas regiões do cloroplasto: matK e rbcL.
Para os microrganismos, os códigos de barras são gerados a partir do RNA ribossômico, sendo o 18S RNAr aplicado para reconhecer procariontes e o 16S RNAr para os eucariotos 6. Quando o código de barras é usado para a identificação síncrona de mais de um organismo, é utilizada a técnica denominada Metabarcoding, capaz de identificar muitas espécies em uma única amostra. Esta técnica, não invasiva, é muito utilizada para mensurar a abundância e riqueza de organismos que habitam determinado ambiente e é obtido da água, do solo, de sedimentos, ou qualquer outra amostra ambiental. CBOL e outros Armazenamentos de Código de Barras de DNA
Após a seleção de cada indivíduo para identificação, é realizado um protocolo para coleta e o sequenciamento do material genético. De posse da sequência genética completa, o armazenamento dos dados é feito em programas computadorizados e remetidos a bancos de dados. Em 2004, foi criado um dos principais órgãos envolvidos no projeto códigos de barra de DNA, o Consórcio para Códigos de Barra da Vida (CBOL) que promove códigos de barra de DNA através de mais de 200 organizações-membro a partir de 50 países, objetivando estabelecer uma ferramenta acurada para a pesquisa taxonômica em espécies animais e vegetais, auxiliar na identificação correta de espécimes e de ampliar e estimular a taxonomia dos vários grupos de organismos vivos.Consortium for the Barcode of Life” (CBOL) (www.barcoding.si.edu)
A submissão dessas sequências segue um rigoroso padrão de qualidade e é acompanhada por outros dados, como descrições morfológicas, fotografias e a informação sobre o museu ou herbário onde a amostra foi depositada. Na qual é recomendável que toda sequência registrada no banco de dados precisa estar associada a uma amostra física, pois, eventualmente, se alguém não concordar com a identificação feita, é possível, por exemplo, solicitar a exsicata e analisar o material.
Atualmente, existem os seguintes projetos de busca e armazenamento dos Códigos de Barra de DNA:
Barcode Index Number (BIN), de domínio público, é o sistema utilizado, principalmente no Barcode of Life Data System (BOLD), para organizar e catalogar a diversidade genética de organismos, que funciona como um identificador único atribuído a um grupo de sequências de DNA mitocondrial que provavelmente representam uma única espécie ou um conjunto muito próximo de espécies estreitamente relacionadas. miniaturadaimagem|395x395px|Interface do site do BOLD System Barcode of Life Database (BOLD), da Universidade de Guelph (Ontário,Canadá), reúne, atualmente, quase três milhões de sequências. A submissão dessas sequências segue um padrão de qualidade e acompanha também outros dados, como descrições morfológicas, fotografias, e o museu ou herbário onde aquela amostra foi depositada.O site do BOLD (boldsystems.org) disponibiliza, além do número atualizado de códigos de barra de DNA existentes no mundo, um portal público de buscas e um portal educacional para possibilitar uma melhor navegação no banco de dados além de tornar possível a contribuição para novos códigos de barra, dentre outras funcionalidades.
Consortium for the Barcode of Life (CBOL), criado em maio de 2004, promove a coleta e pesquisa de códigos de barra de DNA através de mais de 200 organizações-membro localizadas em cerca de 50 países. O Brasil integra este consórcio através do Brazilian Barcode of Life (BrBOL) ( http://brbol.org/pt-br) que visa mapear a grande biodiversidade brasileira. O projeto tem a participação de centenas de instituições, que em sua maioria são brasileiras, havendo também instituições do Canadá, EUA, Espanha, França, Noruega e Reino Unido.
International Barcode of Life ou Código de Barras da Vida Internacional (iBOL) foi criado em Outubro de 2010 e representa um esforço sem fins lucrativos para envolver tanto países em desenvolvimento quanto desenvolvidos, na ideia do “código de barras” mundial, estabelecendo compromissos e grupos de trabalho em 25 países. miniaturadaimagem|252x252px|Interface do site do iBOL