Óxido nítrico sintases (EC number: 1.14.13.39) (NOSs) são uma família de enzimas que catalisam a produção de óxido nítrico (NO) a partir da L-arginina. NO é uma importante molécula de sinalização celular. Ajudam a modular o tônus vascular, a secreção da insulina, o tom das vias aéreas e o peristaltismo, e estão envolvidas na angiogênese e no desenvolvimento neural. Podem funcionar como um neurotransmissor retrógrado. Óxido nítrico é mediado em mamíferos pelo cálcio-calmodulina controlado pelas isoenzimas eNOS (NOS endotelial) e nNOS (NOSneuronal). A isoforma indutível, iNOS, está envolvida na resposta imune, liga a calmodulina em concentrações fisiologicamente relevantes e produz NO como um mecanismo de defesa imunológico, devido ao NO ser um radical livre com um elétron não emparelhado.

NOS catalisa a reação:

2 L-arginina + 3 NADPH + 1 H+ + 4 O2 2 citrulina +2 óxido nítrico + 4 H2O + 3 NADP+

As isoformas da NOS catalisam outros fluxos e reações secundárias, como a produção de superóxido em detrimento do NADPH. Como tal, esta estequiometria não é geralmente observada, e reflete os três elétrons fornecidos por NO pelo NADPH.

Os NOSs são incomuns, pois requerem cinco cofatores. As isozimas NOS eucarióticas são cataliticamente auto-suficientes. O fluxo de elétrons na reação da NO sintase é: NADPH → FAD → FMN → hemo → O2. A tetra-hidrobiopterina fornece um elétron adicional durante o ciclo catalítico que é substituído durante a renovação. NOS é a única enzima conhecida que se liga ao dinucleótido de flavina e adenina (FAD), mononucleótido de flavina (FMN), hemo, tetra-hidrobiopterina (BH4) e calmodulina.CHEBI:61908 - EC 1.14.13.39 (nitric oxide synthase) inhibitorAgapie T, Suseno S, Woodward JJ, Stoll S, Britt RD, Marletta MA. NO formation by a catalytically self-sufficient bacterial nitric oxide synthase from Sorangium cellulosum. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Sep 22;106(38):16221-6. doi: 10.1073/pnas.0908443106. Epub 2009 Sep 10.

Nome: Oxido nítrico sintase (NADPH)

Reação: 2 L-arginina + 3 NADPH + 3 H+ + 4 O2 = 2 L-citrulina + 2 óxido nítrico + 3 NADP+ + 4 H2O (reação geral)

(1a) 2 L-arginina + 2 NADPH + 2 H+ + 2 O2 = 2 Nω-hidroxi-L-arginina + 2 NADP+ + 2 H2O

(1b) 2 Nω-hidroxi-L-arginina + NADPH + H+ + 2 O2 = 2 L-citrulina + 2 óxido nítrico + NADP+ + 2 H2O

Glossario: óxido nitrico = ON = óxido de nitrogênio (II)

Outro (s) nome (s): NOS (nome do gene); óxido nítrico sintetase; enzima formadora de fator de relaxamento derivado do endotélio; fator de relaxamento derivado do endotélio sintase; NO sintase; NADPH-diaforase.

Nome sistemático: L-arginina, NADPH: oxidoredutase de oxigênio (formação de óxido nítrico)

Links para banco de dados: BRENDA, EXPASY, KEGG, MetaCyc, PDB, CAS registry number: 125978-95-2

A enzima consiste em domínios ligados à oxigenase e redutase. A enzima eucariótica se liga ao FAD, FMN, heme (protoporfirina de ferro IX) e tetra-hidrobiopterina, e seus dois domínios estão ligados por meio de um domínio regulador de ligação à calmodulina. Após a ligação da calmodulina induzida pelo cálcio, os domínios redutase e oxigenase formam um complexo, permitindo que os elétrons fluam do NADPH via FAD e FMN para o centro ativo. O domínio redutase da enzima da bactéria Sorangium cellulosum utiliza um cluster [2Fe-2S] para transferir os elétrons do NADPH para o centro ativo.

A enzima NO-sintase catalisa a reação de síntese do NO resultante da oxidação de um dos dois nitrogênios guanidino da L-arginina, que é convertida em L-citrulina.

Uma variedade de isoformas de NOS tem sido purificada em diferentes tecidos de mamíferos e muitas já tiveram seus genes clonados. Estudos bioquímicos e análise seqüencial de aminoácidos revelaram que estas isoformas representam uma família de proteínas e, aparentemente, são produtos de três genes distintos. Assim, as isoformas da NOS são agrupadas em duas categorias, a NOS constitutiva (c-NOS), dependente de íons cálcio (Ca++) e de calmodulina, que está envolvida na sinalização celular, e a NOS induzível (i-NOS), produzida por macrófagos e outras células ativadas por citocinas.

A isoforma I ou óxido nítrico-sintase neuronal (nNOS) é uma NOS constitutiva, presente em neurônios, células epiteliais, SNC e SNPperiférico, sistema NANC, mácula densa do rim, medula adrenal, músculo esquelético, órgão sexual masculino, células b pancreática e outros. É cálcio-calmodulina dependente e regula a transmissão sináptica no SNC; atua na regulação central da pressão sangüínea, no relaxamento do músculo liso e na vasodilatação via nervos periféricos. Também regula o fluxo sangüíneo cerebral local e está envolvida na formação da memória.

A isoforma II ou óxido nítrico-sintase induzida (iNOS) é uma NOS induzida por citocinas e lipopolissacarídeos, no endotélio e musculatura lisa vascular. Não é regulada por cálcio. Produz grande quantidade de NO que tem efeito citostático por inibição de enzimas contendo ferro, também causando fragmentação de DNA. Atua em parasitas e células tumorais.

A isoforma III ou óxido nítrico-sintase endotelial (eNOS) é uma NOS constitutiva e produz NO em endotélio vascular sob condições basais, mas a força de cisalhamento produzida pelo fluxo sangüíneo pode incrementar sua produção. O NO liberado no lúmem vascular é um potente inibidor de adesão e agregação plaquetária na parede vascular e também inibe a adesão de leucócitos ao endotélio vascular, inibe a síntese de DNA, mitogênese e a proliferação de células da musculatura lisa vascular e, também é responsável pela regulação da pressão sangüínea e contratilidade do músculo cardíaco. Sua expressão é restrita a células endoteliais vasculares, embora existam relatos da sua localização no hipocampo, sendo sua expressão em humanos significantemente suprimida pela hipóxia

O NO é sintetizado pela ativação da cNOS basal (em células endoteliais vasculares e neurônios) segundos a minutos após o aumento na concentração de cálcio em resposta à ativação de receptores da superfície celular e mecanismos de transdução de sinal. Sua síntese não é afetada pela administração de glicocorticóides. A cNOS apresenta forma monomérica, é cálcio-calmodulina dependente e tem peso molecular de 133 kd. É expressa continuamente na ausência de agentes indutores, com síntese basal de concentração picomolar.

Ao contrário, a iNOS não depende de cálcio para ativação, mas a síntese de mRNA da iNOS é necessária para sua atividade. A NOS induzida não é detectável em condições basais. LPS ou endotoxinas bacterianas, junto com citocinas, como TNFa , IL-1b ou IF-g , induzem a síntese de iNOS, de 2 a 4 horas após a exposição ao agente. A iNOS requer síntese protéica para sua expressão e sua atividade persiste por mais de 24 horas. É encontrada sob forma de monômero e tetrâmero com peso molecular de 130 kd.

A indução de iNOS pode ser suprimida por TGBb , IL-4, IL-10 sozinhos ou sinergicamente com macrófagos, por IL-8 e por glicocorticóides, que inibem a indução, mas não a atividade das enzimas já induzidas.

Segundo DAVIES e col. (1995), após a indução, iNOS é ativa por 20 horas e sintetiza NO em concentrações nanomolares, 1000 vezes maior que cNOS. A indução da iNOS é responsável pelas propriedades citotóxicas do NO.

O NO é formado na parede vascular tanto pela cNOS como pela iNOS. A quantidade de NO produzida pode determinar se ele é protetório ou tóxico. Embora pequenas quantidades sejam necessárias para a homeostasia, grandes quantidades, como aquelas produzidas na ativação da iNOS são citotóxicas. Porém, a produção de grandes quantidades de NO pode ser importante na defesa contra invasores celulares, tumores celulares e ainda em lesões vasculares com perda endotelial.

A expressão da iNOS é o resultado de uma resposta inflamatória localizada ou difusa resultante de uma infecção ou dano tecidual. Assim, onde a resposta inflamatória é parte de uma resposta adaptativa (isto é, infecção ou sepse), a expressão de iNOS é benéfica; quando a expressão da iNOS é parte da inflamação anormal (não adaptativa), a expressão de iNOS pode ser nociva (isto é, doença autoimune). Do lado benéfico, a expressão da iNOS resulta em inibição do crescimento de patógenos microbianos. A expressão de iNOS também parece proteger tecidos de danos em resposta inflamatória aguda sistêmica, também chamada de sepse. A vasodilatação resultante da expressão de iNOS em vasos sangüíneos maximiza a perfusão tecidual em sepse, embora, se excessiva, a pressão sangüínea possa tornar-se perigosamente baixa. A expressão de iNOS em endotoxemia é citoprotetória, inibindo microtrombose pela prevenção de adesão plaquetária e danos mediados por radicais. Os efeitos benéficos da expressão da iNOS podem ser vistos tanto em infecções localizadas quanto em conseqüências sistêmicas da infecção. O oposto tem sido relatado em respostas inflamatórias crônicas localizadas. A síntese de NO dependente de iNOS por macrófagos no espaço subendotelial e o potencial para sua inibição por lipoproteínas de baixa densidade podem ter um impacto na patogênese dos vasos sangüíneos ateroscleróticos.

A inibição da atividade da iNOS durante sepse pode aumentar a pressão arterial, mas a inibição da cNOS endotelial pode acentuar a agregação plaquetária e aderência de leucócitos ao endotélio resultando em trombose e dano a tecido normal.

Distribuição por espécies

A síntese de NO derivada da arginina foi identificada em mamíferos, peixes, aves, invertebrados e bactérias. Os mais estudados são os mamíferos, onde três genes distintos codificam isozimas de NOS: neuronal (nNOS ou NOS-1), citocina-induzível (iNOS ou NOS-2) e endotelial (eNOS ou NOS-3). iNOS e nNOS são solúveis e encontradas predominantemente no citosol, enquanto o eNOS está associado à membrana. Foram encontradas evidências de sinalização de NO nas plantas, mas os genomas das plantas são desprovidos de homólogos da superfamília que gerem NO em outros reinos.

Funções

Em mamíferos, a isoforma endotelial é o gerador primário de sinal no controle do tônus vascular, secreção de insulina e tônus das vias aéreas, está envolvido na regulação da função cardíaca e na angiogênese (crescimento de novos vasos sanguíneos). NO produzido por eNOS tem demonstrado ser um vasodilatador idêntico ao fator relaxante derivado do endotélio produzido em resposta ao cisalhamento devido ao aumento do fluxo sanguíneo nas artérias. Isso dilata os vasos sanguíneos relaxando o músculo liso em seus revestimentos. eNOS é o principal controlador do tônus muscular liso. NO ativa guanilato ciclase, a qual induz relaxamento muscular suave por: Aumento do cGMP intracelular, que inibe a entrada de cálcio na célula e diminui as concentrações de cálcio intracelular Ativação de canais de K+, o que leva à hiperpolarização e relaxamento Estimula uma proteína quinase dependente de cGMP que ativa a fosfatase da cadeia leve da miosina, a enzima que desfosforila as cadeias leves da miosina, o que leva ao relaxamento muscular suave.

eNOS desempenha um papel crítico no desenvolvimento do coração embrionário e na morfogênese das artérias coronárias e das válvulas cardíacas.

A isoforma neuronal está envolvida no desenvolvimento do sistema nervoso. Funciona como um neurotransmissor retrógrado importante na potenciação a longo prazo e, portanto, provavelmente é importante na memória e na aprendizagem. nNOS tem muitas outras funções fisiológicas, incluindo regulação da função cardíaca e peristaltismo e excitação sexual em homens e mulheres. Uma forma de emenda alternada de nNOS é uma proteína muscular importante que produz sinais em resposta à liberação de cálcio do SR. nNOS no coração protege contra arritmia cardíaca induzida por infarto do miocárdio.