A via da ubiquitina-proteossoma é o principal mecanismo para o catabolismo de proteínas no citosol e no núcleo de mamíferos, possuindo enorme importância para a destruição de proteínas durante o Ciclo Celular. Isso ocorre devido ao fato de haver ampla necessidade de se haver uma degradação ordenada de proteínas para a progressão normal do Ciclo Celular. Dessa forma, a via ubiquitina-proteassoma atua como o principal processo de degradação de proteínas em células eucarióticas.
A partir das ubiquitinas disponíveis, há a formação de cadeias de poliubiquitinas, as quais são ligadas covalentemente a outras proteínas. Tal complexo é reconhecido e proteolisado por um complexo multiproteico denominado proteassomo 26S.
Essa conjugação é um processo bastante complexo o qual é mediado por três grupos de enzimas:
A primeira é o grande grupo de enzimas que ativam a ubiquitina, sendo classificadas como E1. A segunda envolve as enzimas conjugadoras de Ubiquitina, classificadas como E2. A terceira envolve a presença das enzimas ubiquitina-ligases, classificadas como E3.
A maioria das proteínas destinadas à degradação são marcadas pela ligação covalente de múltiplas moléculas de ubiquitina, que fornecem um sinal de reconhecimento para o proteassoma 26S. Porém, a degradação de uma proteína através da Via de Proteassoma da Ubiquitina (UPP) envolve dois passos discretos e sucessivos: marcação da proteína do substrato pela ligação covalente de múltiplas moléculas de ubiquitina (Conjugação), um processo de reconhecimento específico, empregando a cascata de conjugação da ubiquitina; e a subsequente degradação da proteína marcada pelo proteassoma 26S, composto pelo núcleo catalítico 20S e pelo regulador 19S (Degradação). Esta função clássica da ubiquitina está associada às funções de manutenção, regulação do turnover de proteínas e a geração de antígenos peptídicos.
ConjugaçãoMYUNG, J.; KIM, K.; CREWS, C. The Ubiquitin-Proteasome Pathway and Proteasome Inhibitors. Med Res Rev, set. 2008. A ubiquitina liga-se covalentemente a outras moléculas de ubiquitina e/ou a outras proteínas, seja como molécula única ou como cadeias de poli-ubiquitina. A ligação da ubiquitina à ε-amina dos resíduos de lisina das proteínas alvo requer uma série de etapas enzimáticas dependentes de ATP pelas enzimas E1 (ativação da ubiquitina), E2 (conjugação da ubiquitina) e E3 (ligação à ubiquitina). O E3 liga-se a proteínas do substrato e também a um E2 para formar um complexo de substrato E2-E3. É o reconhecimento e a formação do referido complexo que possui o nível mais alto de especificidade de substrato para a cascata de conjugação.
O processo dependente de ATP e de ubiquitina é responsável por atividades intracelulares tão diversas quanto a remoção de proteínas domésticas deformadas ou envelhecidas, a regulação do ciclo celular via degradação da ciclina e a resposta imune celular pelo processamento de peptídeos antigênicos. Esse processo está relacionado com as proteínas mais ubiquitinadas, reconhecidas pelo proteossomo 26S, que são enfiadas na câmara proteolítica 20S de maneira dependente de ATP.
Deconjugação As ligações covalentes de ubiquitina (ligações isopeptídicas), entre a ubiquitina e uma proteína alvo, bem como entre as moléculas de ubiquitina numa cadeia, podem ser revertidas por enzimas desubiquitinantes específicas (English: DUBs-deubiquitinating enzymes). A montagem de DUBs individuais em complexos protéicos distintos permitiu a diversificação da atividade de DUB, necessária para processar as assembleias cada vez mais diversificadas de marcas de monobiquitina e polibiquitina em substratos. Essa regulação dinâmica no sistema de proteassoma ubiquitina é ressaltada pela crescente evidência de que muitos DUBs são parte dos complexos ubiquitina ligase, o que permite que os DUBs regulam a atividade e a abundância tanto da ligase quanto do substrato.
Degradação A Ub (ubiquitina) é conjugada a proteínas que são destinadas à degradação por um processo dependente de ATP que envolve três enzimas. Uma cadeia de cinco moléculas de Ub ligadas ao substrato proteico é suficiente para o complexo ser reconhecido pelo proteassoma 26S. Além das reações dependentes de ATP, Ub é removido e a proteína é linearizada e injetada no núcleo central do proteassoma, onde é digerida em peptídeos. Os peptídeos são degradados em aminoácidos por peptidases no citoplasma ou usados na apresentação de antígenos.
A degradação de proteínas se faz necessária para que haja a remoção de excessode enzimas e outras proteínas quando elas não exercem mais nenhuma função na célula, ou seja, quando se tornam inúteis ou quando há algum tipo de erro no dobramento da proteína, o que a impede de realizar sua função.
Modificadores tipo Ubiquitina (UBLs) Embora a ubiquitina seja o modificador pós-tradução mais bem compreendido, existe uma família crescente de proteínas semelhantes à ubiquitina (UBLs) que modificam alvos celulares em uma via paralela, mas distinta da ubiquitina. Esses modificadores alternativos incluem: SUMO, NEDD8, ISG15, APG8, APG12, FAT10, Ufm1, URM1 e Hub1, que são moléculas relacionadas têm novas funções e influenciam diversos processos biológicos. Existe também uma regulação cruzada entre as várias vias de conjugação, uma vez que algumas proteínas podem ser modificadas por mais do que uma UBL e às vezes até pelo mesmo resíduo de lisina. Proteínas conjugadas a UBLs normalmente não são direcionadas para degradação via proteassoma, mas sim funcionam em diversas atividades regulatórias. A fixação de UBLs pode alterar a conformação do substrato, afetar a afinidade por ligantes ou outras moléculas que interagem, alterar a localização do substrato e influenciar a estabilidade da proteína.
As UBLs são estruturalmente similares à ubiquitina e são processadas, ativadas, conjugadas e liberadas dos conjugados por etapas enzimáticas similares aos mecanismos correspondentes da ubiquitina. Os UBLs também são traduzidos com extensões do terminal C que são processadas para expor o LRGG C-terminal invariante. Esses modificadores possuem suas próprias enzimas E1 (ativadora), E2 (conjugada) e E3 (ligante) específicas que conjugam as UBLs a alvos intracelulares. Estes conjugados podem ser revertidos por isopeptidases específicas de UBL que possuem mecanismos semelhantes aos das enzimas deubiquitinantes.
Enzimas do Sistema Cascata de Ubiquitinação
Enzima ativadora de ubiquitina Pode ser chamada de E1 ou UBA. Um único E1 é entendido como sendo responsável pela ativação da ubiquitina necessária para todas as modificações. Na levedura, por exemplo, apenas um UBA funcional, UBA1, é conhecido por sua atividade de ativação da ubiquitina. Sua deleção é letal em levedura, como esperado, e a mutação de um suposto resíduo de Cys no sítio ativo abole a atividade de E1.
Enzima carreadora de ubiquitina Pode ser chamada também de enzima conjugadora de ubiquitina(UBC) ou E2. Muitas enzimas dessas foram identificadas em, pelo menos, 13 em leveduras (UBC1–13) e mais de 20 em mamíferos, refletindo seu papel em conferir a especificidade para a ubiquitinação de diversos substratos proteicos. Os E2s são subdivididos com base em suas sequências primárias distintas, presumivelmente refletindo suas especificidades diferentes para seus E3s cognatos.
Entre os 13 E2s de levedura conhecidos, apenas UBC3 e UBC9 são codificados por genes essenciais e ambos estão envolvidos na regulação da progressão do ciclo celular. O UBC3 / CDC34, por exemplo, está envolvido na degradação do inibidor SIC1 CDK, o que é necessário para a transição de fase G1 para S, em conjunto com CDC53, SKP1 e CDC4. Além disso, o UBC2 / RAD6 está envolvido no reparo do DNA em cooperação com seu cognato E3α15 para degradar os chamados substratos protéicos da regra da extremidade N. Acredita-se geralmente que os E2s, juntamente com os seus E3 cognatos, reconhecem substratos proteicos específicos. Tais exemplos e E3s específicos serão descritos abaixo com mais detalhes.
Ligases de ubiquitina-proteína Também podem ser chamadas de E3. Esse tipo de ligase reconhece motivos específicos em seus substratos e catalisa a transferência de ubiquitina diretamente ou indiretamente de um intermediário tioéster de seu E2 cognato para formar uma ligação isopeptídica amida entre o substrato protéico e a ubiquitina. Existem alguns mecanismos possíveis para o reconhecimento de substratos protéicos pelos diferentes E3s. Por exemplo, alguns substratos transportam sinais de degradação que são constitutivamente ativos, enquanto outros substratos requerem uma modificação covalente do motivo da sequência, tal como fosforilação. Por outro lado, os próprios E3s podem ser alterados ou ligados a uma proteína auxiliar para reconhecer um subconjunto específico de substratos.
Proteossomo 20S e 26S: Conversão dos pontos dos substratos ubiquitinados O proteossomo 20S possui a estrutura de um barril oco que consiste em quatro anéis heptaméricos empilhados, formando uma câmara central que permite a passagem de moléculas do topo até a base da estrutura. Cada anel é composto por sete subunidades, as quais podem ser classificadas em dois grupos: subunidades α, compõem os dois anéis externos, e subunidades β, compõem os dois anéis internos. Estudos mutagênicos e estruturais revelaram que as treoninas da região amino terminal das subunidades β são os nucleófilos catalíticos. Isso é um contraste com as outras proteases celulares, que possuem seus nucleófilos localizadas em subunidades internas da enzima.
Os proteossomos eucarióticos contém um complexo 19S adicional com função regulatória, que se liga à estrutura 20S para formar a holoenzima, forma mais ativa do proteossomo, denominada proteossomo 26S. O complexo 19S é composto por uma tampa e uma base. A tampa reconhece, de forma extremamente específica, os substratos protéicos ubiquitinizados, enquanto a base, que possui seis estruturas ATPase, é responsável por desdobrar a proteína e empurrá-la no sítio catalítico da enzima, sendo esse processo dependente de ATP. É importante ressaltar que o proteossomo 20S eucariótico possui uma atividade proteolítica modesta enquanto está sozinho, precisando se associar a complexos 19S ou 11S regulatórios para adquirir sua atividade total. Recentemente, foi descoberto que o complexo 19S atua promovendo a abertura de um canal fechado na estrutura do proteossomo 20S, permitindo o acesso para a câmara central dessa estrutura. Similarmente, o complexo regulatório 11S (PA26) mostrou atuar abrindo o canal que separa a câmara central do proteossomo 20S do meio intracelular.
O proteossomo 20S possui múltiplas atividades proteolíticas em uma única câmara proteolítica interna, o que permite que ele, diferentemente de outras proteases, consiga clivar praticamente todas as ligações peptídicas presentes em uma proteína. Tradicionalmente, a atividade proteolítica do proteossomo 20S é expressa pela sua preferência em clivar ligações peptídicas imediatamente depois de um aminoácido específico, um resíduo de aminoácido P1 de um modelo de peptídeos e substratos polipeptídicos naturais. Essa atividade catalítica pode ser referida como “chymotrypsin-like” (CT-L), “trypsin-like” (T-L) e “post-glutamyl peptide hydrolyzing” (PGPH). Além dessas, o proteossomo 20S possui outros dois tipos de atividades proteolíticas: “branched-chain amino acid-preferring” (BrAAP) e “small neutral amino acid-preferring”.
Tentativas de mapear a atividade dos sítios do proteossomo 20S foram feitas para se descobrir quais seriam as subunidades responsáveis por cada uma dessas atividades catalíticas citadas anteriormente. Descobriu-se, por exemplo, que β1 (PRE3) é responsável pela atividade PGPH e que β2 (PUB1) é necessária para a atividade T-L.