Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0Classificação científicaReino:MoneraFilo:TenericutesClasse:MollicutesOrdem:MycoplasmatalesFamília:MycoplasmataceaeGênero:MycoplasmaEspéciesM. mycoidesSubespécie:M. m. JCVI-syn1.0Nome trinomialMycoplasma mycoides JCVI-syn1.0Gibson et al., 2010SinônimoMycoplasma laboratorium Reich, 2000 Mycoplasma laboratorium ou Synthia refere-se a uma espécie sintética de bactéria. O projeto para construir a nova bactéria evoluiu desde o seu início. Inicialmente, o objetivo era identificar um conjunto mínimo de genes necessários para sustentar a vida a partir do genoma de Mycoplasma genitalium e reconstruir esses genes sinteticamente para criar um "novo" organismo. O Mycoplasma genitalium foi originalmente escolhido como base para este projeto porque, na época, possuía o menor número de genes de todos os organismos analisados. Mais tarde, o foco mudou para Mycoplasma mycoides e adotou uma abordagem mais de tentativa e erro.
Para identificar os genes mínimos necessários para a vida, cada um dos 482 genes de M. genitalium foi excluído individualmente e a viabilidade dos mutantes resultantes foi testada. Isso resultou na identificação de um conjunto mínimo de 382 genes que teoricamente deveriam representar um genoma mínimo. Em 2008, o conjunto completo de genes de M. genitalium foi construído em laboratório com marcas d'água adicionadas para identificar os genes como sintéticos. No entanto, o M. genitalium cresce extremamente lentamente e o M. mycoides foi escolhido como o novo foco para acelerar experimentos com o objetivo de determinar o conjunto de genes realmente necessários para o crescimento.
Em 2010, o genoma completo de M. mycoides foi sintetizado com sucesso a partir de um registro de computador e transplantado para uma célula existente de Mycoplasma capricolum que teve seu DNA removido. Estima-se que o genoma sintético usado para este projeto tenha custado US$ 40 milhões e 200 homens-ano para produzir. A nova bactéria conseguiu crescer e recebeu o nome de JCVI-syn1.0, ou Synthia. Após experimentação adicional para identificar um conjunto menor de genes que poderiam produzir um organismo funcional, foi produzido o JCVI-syn3.0, contendo 473 genes. 149 desses genes são de função desconhecida. Como o genoma do JCVI-syn3.0 é novo, é considerado o primeiro organismo verdadeiramente sintético.
Projeto Genoma Mínimo A produção de Synthia é um esforço em biologia sintética no J. Craig Venter Institute por uma equipe de aproximadamente 20 cientistas liderados pelo ganhador do Nobel Hamilton Smith e incluindo o pesquisador de DNA Craig Venter e o microbiologista Clyde A. Hutchison III. O objetivo geral é reduzir um organismo vivo a seus elementos essenciais e, assim, entender o que é necessário para construir um novo organismo a partir do zero. O foco inicial foi a bactéria M. genitalium, um parasita intracelular obrigatório cujo genoma consiste em 482 genes compreendendo 582.970 pares de bases, dispostos em um cromossomo circular (no momento em que o projeto começou, este era o menor genoma de qualquer organismo natural conhecido que pode ser cultivado em cultura livre). Eles usaram a mutagênese do transposão para identificar genes que não eram essenciais para o crescimento do organismo, resultando em um conjunto mínimo de 382 genes. Esse esforço foi conhecido como Projeto Genoma Mínimo.
Escolha do organismo
Mycoplasma Mycoplasma é um gênero de bactérias da classe Mollicutes na divisão Tenericutes, caracterizada pela falta de uma parede celular (tornando-a Gram-negativa) devido ao seu estilo de vida parasitário ou comensal. Na biologia molecular, o gênero recebeu muita atenção, por ser um contaminante notoriamente difícil de erradicar em culturas de células de mamíferos (é imune a beta-lactâmicos e outros antibióticos),Young L, Sung J, Stacey G, Masters JR. "Detection of Mycoplasma in cell cultures". Nat Protoc. 2010 5(5): 929–34. Epub 2010 Apr 22. e por seus usos potenciais como um organismo modelo devido ao seu pequeno tamanho do genoma. A escolha do gênero para o projeto Synthia data de 2000, quando Karl Reich cunhou a frase Mycoplasma laboratorium.
Outros organismos com pequenos genomas A partir de 2005, Pelagibacter ubique (uma α-proteobactéria da ordem Rickettsiales ) possui o menor genoma conhecido (1.308.759 pares de bases) de qualquer organismo de vida livre e é uma das menores células auto-replicantes conhecidas. É possivelmente a bactéria mais numerosa do mundo (talvez 1028 células individuais) e, juntamente com outros membros do clado SAR11, calcula-se que compõem entre um quarto e meio de todas as células bacterianas ou archaeais no oceano. Foi identificado em 2002 por sequências de rRNA e foi totalmente sequenciado em 2005. É extremamente difícil cultivar espécies que não atingem uma alta densidade de crescimento na cultura de laboratório. Várias espécies recém-descobertas têm menos genes que M. genitalium, mas não são de vida livre: muitos genes essenciais que faltam em Hodgkinia cicadicola, Sulcia muelleri, Baumannia cicadellinicola (simbiontes de cigarras) e Carsonella ruddi (simbionte de hackberry pecíolo gall psyllid, Pachypsylla venusta) pode ser codificada no núcleo hospedeiro. O organismo com o menor conjunto conhecido de genes a partir de 2013 é Nasuia deltocephalinicola, um simbionte obrigatório. Possui apenas 137 genes e um tamanho de genoma de 112 kb. Nome da espécieNúmero de genesTamanho (Mbp)Candidatus Hodgkinia cicadicola Dsem 1690,14Candidatus Carsonella ruddii PV 1820,16Candidatus Sulcia muelleri GWSS 2270,25Candidatus Sulcia muelleri SMDSEM 2420,28Buchnera aphidicola str. Cinara cedri 3570,4261Mycoplasma genitalium G37 4750,58Candidatus Phytoplasma mali 4790,6Buchnera aphidicola str. Baizongia pistaciae 5040,6224Nanoarchaeum equitans Kin4-M 5400,49
Técnicas Mycoplasma genitalium JCVI-1.0Classificação científicaReino:BacteriaFilo:TenericutesClasse:MollicutesOrdem:MycoplasmatalesFamília:MycoplasmataceaeGênero:MycoplasmaEspécie:M. genitaliumSubespécie:M. g. JCVI-1.0Nome trinomialMycoplasma genitalium JCVI-1.0Gibson et al., 2008 Várias técnicas de laboratório tiveram que ser desenvolvidas ou adaptadas para o projeto, uma vez que exigia síntese e manipulação de pedaços muito grandes de DNA.
Transplante de genoma bacteriano Em 2007, a equipe de Venter relatou que eles conseguiram transferir o cromossomo da espécie Mycoplasma mycoides para Mycoplasma capricolum por:
isolamento do genoma de M. mycoides : lise suave de células aprisionadas em ágar - ágar fundido misturado com células e deixado para formar um gel - seguido de eletroforese em gel de campo de pulso e a banda do tamanho correto (1,25 Mpb circular) sendo isolada; tornar competentes as células receptoras de M. capricolum : o crescimento em meios ricos seguiu a fome em meios pobres, onde a fome de nucleotídeos resulta na inibição da replicação do DNA e na alteração da morfologia; e transformação mediada por polietilenoglicol do cromossomo circular em células livres de DNA, seguida de seleção.
O termo transformação é usado para se referir à inserção de um vetor em uma célula bacteriana (por eletroporação ou choque elétrico). Aqui, o transplante é usado como transplante nuclear.
Síntese bacteriana de cromossomos Em 2008, o grupo de Venter descreveu a produção de um genoma sintético, uma cópia da sequência G37 de M. genitalium L43967, por meio de uma estratégia hierárquica:
Síntese → 1kbp: A sequência do genoma foi sintetizada por Blue Heron em 1.078 cassetes de 1080bp com sobreposição de 80bp e locais de restrição NotI (cortador ineficiente, porém pouco frequente). Ligação → 10kbp: 109 grupos de uma série de 10 cassetes consecutivas foram ligados e clonados em E. coli em um plasmídeo e a permutação correta foi verificada por sequenciação. PCR Multiplex → 100kbp: 11 Grupos de uma série de 10 conjuntos consecutivos de 10kbp (cultivados em leveduras) foram unidos por PCR multiplex, usando um par de primers para cada conjunto de 10kbp. Isolamento e recombinação → os conjuntos secundários foram isolados, unidos e transformados em esferoplastos de levedura sem uma sequência vetorial (presente no conjunto 811-900).
O genoma deste resultado de 2008, M. genitalium JCVI-1.0, é publicado no GenBank como CP001621.1. Não deve ser confundido com os organismos sintéticos posteriores, rotulados JCVI-syn, baseados em M. mycoides.
Genoma sintético Em 2010, Venter e seus colegas criaram o Mycoplasma mycoides, a cepa JCVI-syn1.0, com um genoma sintético. Inicialmente, a construção sintética não funcionou; portanto, para identificar o erro - que causou um atraso de 3 meses em todo o projeto -, uma série de construções semi-sintéticas foi criada. A causa da falha foi uma mutação de desvio de quadro único no DnaA, um fator de iniciação da replicação.
O objetivo de construir uma célula com um genoma sintético era testar a metodologia, como um passo para criar genomas modificados no futuro. O uso de um genoma natural como modelo minimizou as fontes potenciais de falha. Várias diferenças estão presentes no Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 em relação ao genoma de referência, notadamente um transposon IS1 de E.coli IS1 (uma infecção do estágio de 10kb) e uma duplicação de 85bp, além de elementos necessários à propagação em leveduras e resíduos de sites de restrição.
Houve controvérsia sobre se o JCVI-syn1.0 é um verdadeiro organismo sintético. Enquanto o genoma foi sintetizado quimicamente em muitas partes, ele foi construído para corresponder ao genoma parental de perto e transplantado para o citoplasma de uma célula natural. O DNA por si só não pode criar uma célula viável: proteínas e RNAs são necessários para a leitura do DNA e membranas lipídicas são necessárias para compartimentar o DNA e o citoplasma. No JCVI-syn1.0, as duas espécies usadas como doador e receptor são do mesmo gênero, reduzindo possíveis problemas de incompatibilidade entre as proteínas no citoplasma do hospedeiro e o novo genoma. Paul Keim (geneticista molecular da Universidade do Norte do Arizona em Flagstaff) observou que "existem grandes desafios pela frente antes que os engenheiros genéticos possam misturar, combinar e projetar completamente o genoma de um organismo a partir do zero".
Marcas d'água miniaturadaimagem|Marca d'água oculta em um chip semicondutor de 1976, agindo como uma assinatura de seus criadores. De maneira análoga, JC Venter e sua equipe adicionaram marcas d'água usando códons de terminação para assinar sua criação. Um recurso muito divulgado do JCVI-syn1.0 é a presença de sequências de marcas d'água. As 4 marcas d'água (mostradas na Figura S1 no material suplementar do artigo) são mensagens codificadas escritas no DNA, com comprimento de 1246, 1081, 1109 e 1222 pares de bases, respectivamente. Essas mensagens não usavam o código genético padrão, no qual sequências de 3 bases de DNA codificam aminoácidos, mas um novo código inventado para esse fim, que os leitores eram desafiados a resolver. O conteúdo das marcas d'água é o seguinte:
Marca d'água 1: um script HTML que lê em um navegador como texto parabenizando o decodificador e instruções sobre como enviar um email aos autores para comprovar a decodificação. Marca d'água 2: uma lista de autores e uma citação de James Joyce: "Viver, errar, cair, triunfar, recriar a vida fora da vida". Marca d'água 3: mais autores e uma citação de Robert Oppenheimer (sem créditos): "Veja as coisas não como são, mas como podem ser". Marca d'água 4: mais autores e uma citação de Richard Feynman: "O que não posso construir, não consigo entender".
JCVI-syn3.0 miniaturadaimagem|280x280px|O gene funciona no genoma mínimo do organismo sintético, Syn 3.