thumb|Espectrofotômetro UV/Vis Beckman DU640 Ensaios enzimáticos são métodos laboratoriais para medir a atividade enzimática. São vitais para o estudo da cinética enzimática e da inibição enzimática. São predominantemente realizados por pesquisadores para identificar a presença ou quantidade de uma enzima específica num organismo, tecido ou amostra. Exemplos de tais enzimas incluem α-amilase, catalase, lacase, peroxidase, lisozima e enzimas fosfatase alcalina e luciferase. Diversos reagentes e metodologias estão amplamente disponíveis, o que permite a investigação de interações específicas enzima-substrato.

Unidades de Enzima A quantidade ou concentração de uma enzima pode ser expressa em quantidades molares, igual que com outros compostos químicos, ou em termos de atividade em unidades de enzima.

Atividade Enzimática A atividade de uma enzima é uma medida da quantidade de enzima ativa presente e é assim dependente de várias condições físicas, as quais deveriam ser especificadas.

É calculada usando a seguinte fórmula:

onde = Atividade enzimática = Moles de substrato convertidos por unidade de tempo = Velocidade da reação = Volume de reação

A unidade do SI utilizada é o katal (kat), 1 katal = 1 mol s−1 (mol por segundo), mas esta é uma unidade excessivamente grande. Um valor mais prático e usado é o medido em unidades de enzima (U) = 1 μmol min−1 (micromol por minuto). 1 U corresponde a 16,67 nanokatals.

A atividade enzimática dada em katals geralmente se refere à do substrato alvo considerado natural da enzima. A atividade enzimática pode também ser dada como a que apresenta com certos substratos padrão, como a gelatina, medida então em unidades de digestão de gelatina (GDU, pelas suas siglas em inglês), ou proteínas do leite, medida então em unidades de coagulação do leite (MCU, pelas suas siglas em inglês). As unidades GDU e MCU estão baseadas na rapidez com que um grama da enzima digere a gelatina ou as proteínas do leite, respetivamente. 1 GDU é igual aproximadamente a 1,5 MCU.

O aumento da quantidade de substrato incrementa a velocidade da reação enzimática; porém, uma vez passado certo ponto, a velocidade da reação já não varia porque a quantidade de sítios ativos disponíveis na enzima permanece constante.

Atividade Específica

A atividade específica de uma enzima é outra medida comum. É a atividade de uma enzima por miligrama de proteína total (expresso em μmol min−1 mg−1). A atividade específica dá lugar a uma medida da pureza da enzima na mistura. São os micromoles de produto formados por uma enzima num determinado lapso de tempo (minutos) nas condições dadas por miligrama de proteínas totais. A atividade específica é igual à velocidade de reação multiplicada pelo volume de reação dividido pela massa de proteína total. A unidade do SI é o katal/kg, mas uma unidade mais prática é μmol/(mg*min).

A atividade específica é uma medida da processividade da enzima (a capacidade da enzima de processar), a uma concentração de substrato específica (geralmente saturante), e costuma ser constante para uma enzima pura.

Pode realizar-se um processo de titulação de um sítio ativo eliminando os erros que se originam pelas diferenças no cultivo de lotes e/ou o pregamento incorreto da enzima e outros assuntos similares. Esta é uma medida da quantidade de enzima ativa, calculada por, por exemplo, titulação da quantidade de sítios ativos presentes empregando um inibidor irreversível. A atividade específica deveria então ser expressa como μmol min−1 mg−1 de enzima ativa. Se conhecermos o peso molecular da enzima, o número de recâmbio ou de turnover, ou μmol de produto por segundo por μmol de enzima ativa, pode ser calculado a partir da atividade específica. O número de recâmbio pode ser visualizado como o número de vezes que cada molécula de enzima leva a cabo o seu ciclo catalítico por segundo.

Terminologia Relacionada

A velocidade de uma reação é a concentração de substrato que desaparece (ou de produto produzido) por unidade de tempo (mol L−1 s−1).

A % de pureza é 100 % \times (\text{atividade específica da amostra de enzima / atividade específica de enzima puro}). A amostra impura tem uma menor atividade específica porque parte da massa não é na realidade enzima. Se conhecermos a atividade específica de uma enzima pura a 100 %, então uma amostra impura terá uma menor atividade específica, o que permite calcular a pureza e depois obter um resultado claro.

Tipos de Ensaios Todos os ensaios de enzimas medem o seu consumo de substrato ou a sua produção de produto com a passagem do tempo. Existem um grande número de métodos de medida das concentrações de substratos e produtos e muitas enzimas podem ser ensaiadas de várias maneiras. Os bioquímicos costumam estudar as reações catalisadas por enzimas usando quatro tipos de experimentos:

Experimentos de velocidade inicial. Quando se mistura uma enzima com um grande excesso de substrato, acumula-se o intermediário enzima-substrato numa rápida transição. Depois a reação atinge uma cinética de estado estável na qual os intermediários enzima-substrato permanecem aproximadamente constante com o tempo e a velocidade da reação muda de forma relativamente lenta. As velocidades são medidas durante um curto período de tempo depois de alcançar o estado quase estável, normalmente monitorizando a acumulação do produto com o tempo. Como as medidas se realizam durante um curto período de tempo e devido ao grande excesso de substrato, pode fazer-se a aproximação de que a quantidade de substrato livre é aproximadamente igual à quantidade de substrato inicial. O experimento de velocidade inicial é o experimento mais simples de realizar e analisar, estando relativamente livre de complicações como reações revertidas (back-reaction) e a degradação da enzima. É, por tanto, com diferença o tipo de experimento mais utilizado em cinética enzimática. Experimentos de curva de progresso. Nestes experimentos, os parâmetros cinéticos são determinados a partir de expressões das concentrações de espécies em função do tempo. A concentração dos substratos ou produtos é registada no tempo depois da rápida transição inicial e por um período o suficientemente longo para permitir que a reação se aproxime ao equilíbrio. Os experimentos de curva de progresso foram muito usados na etapa inicial da cinética enzimática, mas são menos comuns agora. Experimentos de cinética transiente. Nestes experimentos, rastreia-se o comportamento da reação durante a transição rápida inicial à medida que o intermediário chega ao período de cinética de estado estável. Estes experimentos são mais difíceis de realizar do que os dois mencionados antes porque requerem técnicas especializadas (como a fotólise flash de compostos aprisionados) ou a mistura rápida (como o fluxo interrompido, fluxo atemperado ou fluxo contínuo). Experimentos de relaxação. Nestes experimentos, perturba-se uma mistura em equilíbrio de enzima, substrato e produto, por exemplo por um salto de temperatura, de pressão ou de pH, e monitoriza-se o retorno ao equilíbrio. A análise destes experimentos deve considerar a reação reversível total. Além disso, os experimentos de relaxação são relativamente insensíveis a detalhes da mecânica e não são normalmente usados para a identificação do mecanismo, ainda que possam ser utilizados para isso sob as condições apropriadas.

Os ensaios de enzimas podem ser divididos em dois grupos de acordo com o seu método de amostragem: ensaios contínuos, nos quais o ensaio dá uma leitura contínua da atividade, e ensaios descontínuos, nos quais se tomam as amostras, a reação é detida e depois é determinada a concentração de substratos/produtos.

miniatura|esquerda|Portador de cubeta num espectrómetro controlado pela temperatura.

Ensaios Contínuos Os ensaios contínuos são os mais convenientes, já que o ensaio dá a velocidade da reação sem que seja necessário nenhum trabalho adicional. Há muitos tipos de ensaios contínuos.

Espectrofotométrico Em ensaios espectrofotométricos, seguem o curso da reação medindo uma alteração na quantidade de luz que absorve a solução do ensaio. Se esta luz está na região visível pode ver-se uma alteração de cor no ensaio, e estes ensaios denominam-se ensaios colorimétricos. O ensaio MTT, um ensaio redox no qual se usa uma tintura tetrazólio como substrato é um exemplo de ensaio colorimétrico.

Com frequência é usada luz UV, já que as coenzimas comuns NADH e NADPH absorvem luz UV nas suas formas reduzidas, mas não nas suas formas oxidadas. Uma oxidorredutase que usa NADH como substrato pode, portanto, ser ensaiada seguindo o decréscimo na absorvância UV ao comprimento de onda de 340 nm; à medida que o coenzima é consumido.

Ensaios diretos e ensaios acoplados miniatura|320px|Ensaio acoplado para a hexoquinase usando glicose-6-fosfato desidrogenase. Mesmo quando a reação enzimática não causa uma alteração na absorvância de luz, ainda é possível usar um ensaio espectrofotométrico para a enzima utilizando um ensaio acoplado. Nestes ensaios, o produto de uma reação é utilizado como substrato de outra reação facilmente detetável. Por exemplo, a figura 1 mostra o ensaio acoplado para a enzima hexoquinase, que se pode fazer acoplando a sua produção de glicose 6-fosfato à produção de NADPH, empregando a enzima glicose-6-fosfato desidrogenase.

Fluorométrico A fluorescência é produzida quando uma molécula emite luz de um comprimento de onda depois de absorver luz de outro comprimento de onda diferente. Os ensaios fluorométricos usam uma diferença na fluorescência do substrato em relação à do produto para medir a reação enzimática. Estes ensaios são em geral muito mais sensíveis do que os ensaios espectrofotométricos, mas podem ter interferências causadas por impurezas e pela inestabilidade de muitos compostos fluorescentes quando expostos à luz.

Um exemplo destes ensaios é outra vez o uso de coenzimas nucleótidos como o NADH e NADPH. As suas formas reduzidas são fluorescentes e as oxidadas não. As reações de oxidação podem, portanto, ser seguidas por uma diminuição na fluorescência, e as reações de redução por um incremento. Também se dispõe de substratos sintéticos que liberam uma tintura fluorescente numa reação catalisada por uma enzima, como o 4-metilumbeliferil-β-D-galactosídeo para ensaiar a β-galactosidase ou o 4-metilumbeliferil-butirato para ensaiar a lipase de Candida rugosa.

Calorimétrico miniatura|Quimioluminescência do luminol. A calorimetria nos ensaios enzimáticos é a medida do calor liberado ou absorvido pelas reações químicas. Estes ensaios são muito gerais, já que muitas reações envolvem alguma alteração no calor e com o uso de um microcalorímetro não é preciso utilizar muita enzima ou substrato. Estes ensaios podem ser usados para medir reações que são impossíveis de ensaiar de nenhuma outra maneira.

Quimioluminescente

A quimioluminescência é a emissão de luz por uma reação química. Algumas reações enzimáticas produzem luz e isto pode ser medido para detetar a formação de produto. Estes tipos de ensaio podem ser extremamente sensíveis, já que a luz produzida pode ser capturada por uma película fotográfica durante dias ou semanas, mas pode ser difícil de quantificar porque não se vai poder detetar toda a luz liberada pela reação.

A deteção da peroxidase do rábano picante por quimioluminescência enzimática é um método comum de deteção de anticorpos nos western blotting. Outro exemplo é a enzima luciferase, que se encontra em vaga-lumes e produz de forma natural luz a partir do seu substrato luciferina.

Dispersão da Luz