Протео́мика () — область молекулярной биологии, посвящённая идентификации и количественному анализу белков (иными словами, высокопроизводительному исследованию белков). Термин «протеомика» был предложен в 1997 году. Совокупность всех белков клетки называют протеомом.

Объектом изучения протеомики являются белки, которые экспрессируются в клетке, ткани или организме в данный момент времени (то есть протеом). Хотя первые методы протеомики, например, секвенирование белков по Эдману, появились задолго до геномных технологий, действительно высокопроизводительное изучение белков стало возможным только в постгеномную эпоху, то есть при наличии известных нуклеотидных последовательностей геномов разных организмов.

Задачи и значение После геномики и транскриптомики, протеомика — следующий шаг в изучении биологических систем. Основная задача протеомики заключается в идентификации новых белков и их количественном анализе. Соответственно, протеомика объективно сложнее геномики, так как геном организма в большинстве случаев не меняется в ходе жизни, но совокупность всех его белков изменяется постоянно. Различаются даже протеомы клеток разных типов одного организма. Кроме того, изучение протеома осложняется и другими обстоятельствами, например, посттрансляционными модификациями, которым подвергаются многие белки (изучением посттрансляционных модификаций занимаются разделы протеомики — и ). Для активности многих белков критически необходимы взаимодействия с другими белками и с РНК, что также осложняет их идентификацию. Наконец, некоторые белки существуют так недолго и столь быстро разрушаются, что их очень сложно зафиксировать имеющимися методами.

Данные, полученные методом протеомики, могут быть использованы для формирования более глубокого понимания причин возникновения разнообразных заболеваний, например, нейродегенеративных, а также разработки методов лечения. С помощью протеомики осуществляется поиск антигенов, пригодных для создания новых вакцин. Идентификация белков, которые аномально экспрессируются при различных раковых заболеваниях, имеет огромное значение для диагностики с помощью биомаркеров, прогнозирования и лечения рака.

Методы Традиционный подход к изучению белков подразумевает их выделение из тканей и клеток, последующую очистку, в результате чего становится возможным анализировать структуру и функции очищенного белка. Протеомика использует другой подход: всё белковое содержимое клетки можно увидеть и проанализировать в одну стадию. Это стало возможным благодаря появлению и развитию таких методов и технологий, как масс-спектрометрия и двумерный электрофорез. Однако методы протеомики не исчерпываются этими двумя примерами. Ниже рассмотрены использующиеся на данный момент методы исследования белков, в том числе методы количественного анализа и секвенирования аминокислотной последовательности белка, которые на современном этапе используются редко.

Количественный анализ, не требующий информации о структурах белков Количественный анализ белков с ферментативной активностью можно опосредованно проводить через этих белков. Ещё в начале XX века подобный анализ можно было осуществить с помощью методов спектрофотометрии. При этом количество катализатора оценивается в условных единицах активности. Условные единицы активности до сих пор используют для описания концентрации в крови таких биомаркеров, как аланинаминотрансфераза и аспартатаминотрансфераза. В 1975 году был разработан способ получения моноклональных антител, и они быстро нашли применение в исследовании белков. Например, если известен антиген данного антитела, то с помощью этого антитела можно идентифицировать исследуемый антиген в экспериментальном образце. В медицине в качестве биомаркеров и в XXI веке широко используются антитела, антигены которых неизвестны, но которые связывают у больных людей гораздо больше антигена, чем у здоровых. Например, гликопротеин CA-125 использовали как биомаркер рака яичников с 1981 года, когда были получены антитела к нему. Значительно позднее идентифицировали сам белок — муцин 16.

Секвенирование последовательности белка

В 1953 году Фредерик Сенгер определил аминокислотную последовательность гормона инсулина. Для мечения и идентификации N-концевого остатка Сенгер предложил использовать . После связывания с этим реагентом N-концевого остатка белка полипептидную цепь гидролизуют соляной кислотой до отдельных аминокислот и выявляют меченный остаток. Если белок состоит из нескольких полипептидных цепей, то пометятся оба N-концевых остатка, то есть будет установлено число отдельных полипептидных цепей в белке. Для секвенирования всей белковой последовательности чаще применяют метод секвенирования по Эдману.

В 1950-х годах шведский химик изобрёл метод определения аминокислотной последовательности белков (секвенирование). Первый этап секвенирования по Эдману — обработка исследуемого пептида изотиоцианатом фенила, который взаимодействует с аминогруппой, давая фенилтиокарбомоильный радикал. При умеренном закислении раствора он отщепляется, захватывая вместе с собой N-концевую аминокислоту. В результате в раствор выходит тиазолинон с радикалом, специфичным для данной аминокислоты. Это производное анализируют хроматографически, определяя, какая аминокислота была на N-конце, и цикл повторяется. Если исследуемый белок закреплён на твёрдой подложке, то после каждой обработки изотиоцианатом фенила его можно промывать, удаляя тиазолинон с N-концевой кислотой, и начинать новый цикл. Метод Эдмана позволяет с высокой точностью определять последовательность длиной до 30 аминокислотных остатков. Высокая чувствительность метода также позволяет секвенировать менее 0,1 нмоль пептида с 99 % точностью. Длина полипептидной цепи, которую можно секвенировать методом Эдмана, зависит от эффективности отдельных стадий, которая, в свою очередь, определяется аминокислотным составом полипептида.

В 1960-х годах был создан автоматический секвенатор, реализующий метод Эдмана. Первичную структуру инсулина, на определение которой у Сенгера ушло более 10 лет, в настоящее время можно получить за пару дней прямым секвенированием на белковом секвенаторе. Метод Эдмана сейчас изредка используют при исследовании организмов, геномные последовательности которых неизвестны. Традиционное секвенирование белков также применяют в тех случаях, когда многие их особенности (например, посттрансляционные модификации) нельзя узнать только лишь из последовательности гена.

Большинство белков перед секвенированием необходимо приготовить к нему особым образом. Сначала в белке́ разрушают дисульфидные связи, если они есть, при помощи окисления надмуравьиной кислотой или восстановления дитиотреитолом. Далее белковую цепь дробят на фрагменты протеазами, поскольку секвенирование длинных белков имеет невысокую точность. Обычно для гидролиза используют трипсин, который действует только на те пептидные связи, карбонильная группа которых принадлежит остатку лизина или аргинина. Поэтому, если при полном гидролизе определить число лизиновых и аргининовых остатков в белке, можно предсказать, на сколько фрагментов распадётся белок после обработки трипсином. Полученные фрагменты далее чистят с помощью электрофореза (см. ниже) или хроматографии и секвенируют по Эдману. Чтобы восстановить последовательность белка по фрагментам, его разрезают на куски ферментом, который распознаёт остатки, отличные от тех, которые распознаёт трипсин. На основании перекрытий двух полученных наборов фрагментов восстанавливают полную аминокислотную последовательность белка.

Для определения положения дисульфидных связей белок снова расщепляют трипсином, но не разрушая предварительно дисульфидные связи. Образующиеся фрагменты разделяют электрофорезом и сравнивают с набором фрагментов, полученных при первом расщеплении трипсином. Если между двумя фрагментами есть дисульфидная связь, то при разделении первого набора фрагментов они будут выглядеть на геле как две полосы, а при электрофорезе второго образуют единую полосу.

Двумерный гель-электрофорез

В 1970—1980-х годах достигли расцвета методы выделения и очистки белков. Эти методы сочетали принципы хроматографии, электрофореза и центрифугирования; многие из них давно вышли из употребления, но некоторые используются и в XXI веке. В 1970 году швейцарский учёный предложил метод разделения белков при помощи электрофореза в денатурирующих условиях. Сначала белки подвергали жёсткой денатурации под действием додецилсульфата натрия (), который в виде слоя покрывал каждую белковую молекулу. Чем больше был белок, тем больше SDS связывалось с ним и тем больший отрицательный заряд приобретал их комплекс. Поэтому при нанесении образцов на полиакриламидный гель они начинали двигаться под действием электрического поля; при этом скорость движения белковых молекул зависит от их массы (более лёгкие белки перемещаются по гелю быстрее). Метод хорошо подходит для разделения белков с массой от 5 до 250 кДа.

Метод Лэммли получил дальнейшее развитие. В 1975 году Патрик О’Фарелл и Йоахим Клозе независимо друг от друга предложили принцип так называемого двумерного электрофореза: перед разделением по массе с помощью SDS белки предварительно разделяются согласно их изоэлектрической точке. Сначала белки вносят в стеклянную трубку, заполненную особыми полимерами, которые создают в ней неподвижный градиент pH. Белки распределяются по трубке, занимая места, pH которых равен их изоэлектрической точке. Далее содержимое трубки выдавливают и приплавляют к гелю для обычного электрофореза по Лэммли. Таким образом, сначала белки делятся по изоэлектрической точке, а потом по массе. В результате двумерного электрофореза каждому белку соответствует не полоса, как при обычном электрофорезе, а сфокусированное округлое пятно, размер и интенсивность окрашивания которого соответствуют концентрации белка. С помощью двумерного электрофореза можно разделять не только различные белки, но и изоформы одного и того же белка, а также формы белка с разными посттрансляционными модификациями. Были предложены различные усовершенствования методики двумерного электрофореза, некоторые его этапы, а также обработка отсканированных гелей, были автоматизированы. По сути, двумерный электрофорез — единственный способ наглядного представления протеома.

Вестерн-блоттинг

В ряде случаев необходимо установить, с какими клеточными белками взаимодействуют выделенные антитела. Нередко стоит и обратная задача: определить выделенный белок можно с помощью антител, специфически с ним связывающихся. Для этого существует метод вестерн-блоттинга, или иммуноблоттинга. При его применении вначале белки из исследуемого лизата разделяют при помощи гель-электрофореза, а из геля переносят на пористую мембрану. Далее мембрану последовательно обрабатывают антителами, специфичными к искомому белку, и радиоактивно-меченными антителами, связывающимися с первыми антителами. Иногда вместо вторых антител производят ферментативную реакцию с первыми антителами. В результате молекулы искомого белка, распознанные антителами, выявляются как полосы на авторадиограмме или пятна на мембране, по которым можно идентифицировать белок.

Масс-спектрометрия