Vault, или цитоплазмати́ческий рибонуклеопротеи́н vault (), — эукариотическая органелла, химически представляет собой рибонуклеопротеин. Под электронным микроскопом эти органеллы напоминают свод купола собора с осью симметрии 39-го порядка. Функции vault плохо изучены, однако к настоящему времени имеются свидетельства об участии их в различных сигнальных путях клетки. Возможно, vault вовлечены в развитие явления множественной лекарственной устойчивости к противораковой химиотерапии. Они имеются во многих типах эукариотических клеток и высококонсервативны среди эукариот.
История изучения Vault были открыты и успешно выделены из печени крысы в 1986 году клеточным биологом Нэнси Кедерша () и биохимиком () из Школы Медицины Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе. Первоначально vault были описаны как яйцевидные частицы, загрязнявшие препараты окаймлённых клатрином везикул. Частицы были выделены с помощью центрифугирования в сахарозы и электрофореза в агарозном геле. Оказалось, что они имеют симметричную бочонковидную структуру, похожую на свод готического собора, за что частицы и получили своё название (от — свод). Первоначально размер vault был оценен в 35 × 35 × 65 нм³, но позднее с использованием методов криоэлектронной микроскопии он был уточнён до 41 × 41 × 72,5 нм³. Таким образом, vault являются самыми крупными из когда-либо описанных цитозольных неикосаэдрических нуклеопротеинов. Далее структура vault изучалась с помощью рентегноструктурного анализа и ядерного магнитного резонанса. В 2009 году структура vault из печени крысы была определена с разрешением 3,5 Å.
Структура vault
Vault — самые крупные рибонуклеопротеиновые частицы. По размерам они примерно в 3 раза превосходят рибосому и весят около 13 МДа. Vault состоят по большей части из белков, в связи с чем их трудно окрашивать стандартными методами. Белковая составляющая vault представлена множеством молекул (MVP) (95,8 кДа), на долю которого приходится более 70 % всего белка в частице, а также белками VPARP (∼192 кДа) и (∼291 кДа). Кроме того, в состав vault входят vault РНК () длиной 86—141 нуклеотидов. Общая масса РНК в vault оценивается в ∼460 кДа.
Частица vault достигает около 670 Å в длину и имеет наибольший диаметр ∼400 Å. Стенка имеет толщину лишь в 15–25 Å; внутри неё находится полость длиной около 620 Å и максимальным диаметром ∼350 Å. Частица состоит из двух симметричных половин, каждая из которых состоит из трёх частей: тела, плечевого участка и шапочки. Тело содержит 78 копий 9 повторяющихся структурных доменов MVP (39 копий в каждой половине), сужающаяся часть сформирована связанными конец к концу структурными повторяющимися доменами R1. Высота плечевого участка составляет ∼25 Å, а диаметр ∼315 Å. Шапочки имеются на обоих концах частицы, и каждая из них содержит 39 копий домена шапочка-спираль (аминокислотные остатки MVP с Asp647 пр Leu802) и домена шапочка-кольцо (с Gly803 по Ala845). Высота шапочки составляет ∼155 Å, а внутренний и внешний диаметры домена шапочка-кольцо достигают ∼50 Å и ∼130 Å соответственно.
MVP содержит 9 повторяющихся структурных доменов (R1—R9). Домены R8 и R9 состоят из пяти антипараллельных β-листов, обозначаемых S1, S2, S3, S4 и S5. В оставшихся семи доменах имеется два дополнительных β-листа (S2a и S2b), вставленных между S2 и S3. По некоторым данным, R1, как и R8 и R9, состоит из пяти антипараллельных β-листа, в то время как у R2 имеется два более длинных антипараллельных листа между S2 и S3. Каждый домен имеет . Анализ аминокислотных последовательностей показал, что в R3 и R4, возможно, имеются два домена типа . Дальнейшее изучение показало, что MVP взаимодействует с другими белками, такими как PTEN, через предполагаемые два домена EF hand при участии ионов Ca2+, впрочем, с этим согласуются не все экспериментальные данные.
Плечевой участок (с Pro520 по Val646) сворачивается в один α/β-глобулярный домен с 4 антипараллельными бета-листами на одной стороне и четырьмя α-спиралями на другой. По-видимому, именно в плечевом участке находятся элементы, отвечающие за взаимодействие vault с липидными рафтами.
Домен шапочка-спираль сворачивается в α-спираль из 42 витков, которая укладывается в суперспираль. Домен шапочка-кольцо расположен на конце шапочки и формирует U-образную структуру со спиральными элементами на обоих концах.
vРНК располагаются в шапочках на концах частиц vault. Белок TEP1, по-видимому, располагается в верху плоской части шапочки, где его участок формирует структуру типа кольцевой . N-концевая часть TEP1 содержит 4 повторяющихся домена неясного функционального назначения, РНК-связывающий домен и ATP/GTP-связывающий домен. Было показано, что TEP1 взаимодействует с и различными человеческими vРНК. VPARP располагаются в основном в шапочке vault.
В следующей таблице обобщены основные сведения о компонентах vault. Компонент Характеристика Локус Положение и взаимодействия в vault Функции MVP 96 копий белка составляют основную массу vault. Способны самособираться в vault. Не имеют функций вне vault 16p11.2 Тело и шапочка vault, нет необходимых партнёров Структурная; управляют связыванием с сигнальными белками VPARP Слабая поли(ADP-рибоза)-полимераза, лишь частично связана с vault 13q11 Шапочка, непосредственно связываются с N-концевой частью MVP Каталитическая: поли(ADP)-рибозилирование MVP TEP1 Связывается с теломеразой и vault; не необходим для теломеразы 14q11.2 Шапочка, непосредственное связывание с MVP Каталитическая: сборка vРНК-мишеней в vault vРНК hgv1—3, hgv4 не экспрессируется; лишь частично связаны с vault 5q33.11 Xp11.22 Шапочка, связываются с TEP1 Неструктурная, функции плохо изучены
Функции Широкое распространение vault и их эволюционная консервативность говорят в пользу наличия у этих органелл важных биологических функций, хотя о них известно очень мало. Ничего не известно об изначальных функциях vault в клетках протистов. Тем не менее, имеется несколько предположений относительно роли vault в клетках млекопитающих. В частности, отмечено, что vault особенно много в тканях и клетках, связанных с очисткой организма, например, макрофагах.
Была высказана гипотеза, что vault служат главными «пробками» в ядерных поровых комплексах. Иммунофлуоресцентный анализ с использованием антител против vault показал, что в изолированных ядрах клеток печени крысы vault располагались на поверхности ядерной мембраны. Иммуноэлектронная микроскопия с использованием , конъюгированных с золотом, показала, что в изолированных ядрах vault ассоциированы с ядерными поровыми комплексами. Поэтому, возможно, vault могут принимать участие в нуклеоцитоплазматическом транспорте.
В 2005 году было высказано предположение, что человеческие vРНК hvg1 и hvg2 могут связываться с противораковым препаратом митоксантроном, а также играть важную роль в экспорте токсичных соединений. Впрочем, другое исследование показало, что нарушение работы гена MVP у мышей не приводило к повышению чувствительности к цитостатическим препаратам. Более того, мыши дикого типа и мыши, дефектные по MVP, демонстрировали одинаковый ответ на доксорубицин. В ходе ещё одного исследования было показано, что нокдаун MVP при помощи малых интерферирующих РНК не влиял на удаление доксорубицина из ядра. Кроме того, повышение экспрессии MVP у хемочувствительных клеток не повышало устойчивости к препаратам. Эти результаты говорят в пользу того, что MVP и vault не вносят непосредственный вклад в устойчивость к цитостатическим агентам.
Ряд недавних исследований показал участие vault в различных сигнальных путях клетки, и количество таких путей постоянно растёт. На дрожжевой двугибридной системе было показано, что MVP может связываться с PTEN — белком-супрессором опухолей, который , отрицательно регулируя сигнальный путь фосфоинозитид-3-киназы/протеинкиназы В. N-концевой фосфоинозитид-связывающий мотив и домен С2 PTEN могут взаимодействовать с MVP. MVP является субстратом для , содержащей домен (Src homology 2), и служит в сигнальном пути эпидермального фактора роста (EGF). Оказалось, что SH2-домены SHP-2 связывались с MVP, фосфорилированным по остаткам тирозина, и это связывание усиливалось под действием EGF. Таким образом, MVP функционирует как белок скэффолда для SHP-2 и киназ, регулируемых внеклеточно, и регуляция фосфорилирования MVP через SHP-2 может иметь важное значение для выживания клетки. Кроме того, было показано взаимодействие между MVP и доменом SH2 Src в клетках желудка человека и клетках рака желудка 253J. Иммунопреципитация и иммунофлуоресцентный анализ показали, что EGF усиливал взаимодействие между MVP и Src, и оно блокировалось под действием ингибитора Src . EGF также стимулирует перемещение MVP из ядра в цитозоль и околоядерную зону цитоплазмы, где MVP колокализуется с Src. Предполагается роль MVP как нового регулятора Src-опосредованных сигнальных каскадов. Было установлено, что MVP является белком, индуцируемым интерфероном γ (IFN-γ): в ответ на IFN-γ наблюдалось значительное повышение уровня мРНК и самого белка MVP. Эта активация вовлечена во взаимодействие STAT1 и сайта, активируемого IFN-γ, в проксимальном промоторе MVP. Кроме того, IFN-γ значительно повышал темпы трансляции MVP. Показано, что vault могут взаимодействовать с эстрогеновыми рецепторами при связывании с эстрадиолом и вместе с рецепторами переносятся в ядро. Согласно последним данным, vault и MVP могут взаимодействовать с инсулиноподобным фактором роста 1, HIF1A, а также затрагивать два главных процесса репарации двуцепочечных разрывов в ДНК: негомологичное соединение концов и гомологичную рекомбинацию. Таким образом, частицы vault функционируют как центральные платформы взаимодействия в клеточных сигнальных каскадах.
VRARP, другой белок, входящий в состав vault, является поли(ADP-рибоза)-полимеразой.
Необычная структура и своеобразная динамика vault, а также их крупный размер наводят на мысль, что, возможно, vault функционируют как природные наноконтейнеры для ксенобиотиков, нуклеиновых кислот и белков. Ведутся работы по разработке рекомбинантных vault, в частности, по обеспечению взаимодействия vault с поверхностными клеточными рецепторами и заключению в них разнообразных грузов.
В следующей таблице обобщены основные сведения о белках, с которыми взаимодействуют vault. Белок Характеристика Локус Взаимодействие с vault Функции, связанные с vault PTEN Белок-супрессор опухолей, главная ингибиторная фосфатаза пути PI3K. Главный субстрат PIP3 10q23.3 MVP (N-конец), Ca2+-зависимое взаимодействие Усиление ядерных функций PTEN SHP-2 Протеинтирозинфосфатаза; активатор роста, опосредованного рецепторными тирозинкиназами (RTK) 3q13.13 MVP (зависимое от фосфорилирования MVP взаимодействие) Стимулирование EGRF-опосредованной MAPK-активности Erk2 Митоген-активируемая тирозинкиназа; главный передатчик RTK-опосредованных сигналов пролиферации 22q11.22 MVP (зависимое от фосфорилирования MVP взаимодействие) Стимулирование EGRF-опосредованной MAPK-активности Src (Прото)онкоген, тирозинкиназа 20q11.2 MVP (зависимое от фосфорилирования MVP взаимодействие) Стимулирование EGRF-опосредованной MAPK-активности E3 убиквитинлигаза, у позвоночных разрушает и p53 1q25.1—1q25.2 MVP (фосфорилирование MVP, уменьшающееся от УФ-излучения) Подавляет EGF-опосредованную активацию MAPK Эстрогеновый рецептор Ядерный рецептор гормона эстрадиола, индуцирует лиганд-зависимую транскрипцию генов-мишеней 6q25.1 MVP (гормонзависимое взаимодействие) Ядерный импорт и активация эстрогенового рецептора La Связывает и защищает 3'-концевые элементы UUU(OH) транскриптов, синтезированных РНК-полимеразой III 2q31.1 vРНК Защита vРНК
Клиническое значение Рак