BWA () — программный пакет для картирования коротких прочтений на большие референсные геномы (такие как, например, геном человека), написанный китайским биоинформатиком и англичанином . Является одним из широкоиспользуемых алгоритмов выравнивания, а также рекомендуется для анализа данных производителями Illumina. BWA состоит из трёх основных алгоритмов: BWA-BackTrack, BWA-SW и BWA-MEM. В основе алгоритмов BWA лежит преобразование Барроуза—Уилера, суффиксные массивы и алгоритм выравнивания Смита—Ватермана. Программный пакет умеет работать с длинными последовательностями на порядок быстрее, чем MAQ () при достижении аналогичной точности выравнивания.

Для образцов c платформ Illumina-SOLEXA, 454 Life Sciences, ионного полупроводникового секвенирования или секвенирования по Сэнгеру с длиной чтений («ридов» от  — «чтение, прочтение»; отдельные фрагменты ДНК, полученные в результате работы секвенатора) больше или равных 70 пар оснований (здесь и далее — п.о.), BWA-MEM обычно предпочтительней. BWA-MEM и BWA-SW имеют схожие функции, такие как, например, поддержка длинных прочтений. BWA-MEM имеет лучшую производительность, чем BWA-BackTrack для чтений длиной 70—100 п.о. с платформы Illumina-SOLEXA.

Независимо от выбранного алгоритма программный пакет BWA сначала должен построить FM-индекс для референсного генома. Для создания индекса используется следующая команда: bwa index [-p prefix] [-a algoType] <in.db.fasta>. Далее к полученным данным применяются алгоритмы выравнивания, которые вызываются различными подкомандами: aln/samse/sampe для BWA-BackTrack, bwasw для BWA-SW и mem для BWA-MEM.

История Хенг Ли, научный сотрудник Кембриджского института Броуда, начал писать первую часть кода 24 мая 2008 года и получил первоначальную стабильную версию уже 2 июня того же года. В этот же период профессор Tak-Wah Lam, первый автор статьи BWT-SW, сотрудничал с в работе над SOAP2, преемником SOAP (пакет анализа коротких олигонуклеотидных последовательностей). SOAP2 вышел в ноябре 2008 года.

Алгоритм BWA-SW является новым компонентом BWA. Он был задуман в ноябре 2008 года и реализован спустя десять месяцев. По состоянию на 2015 год BWA-MEM (0.7.10) считался более предпочтительным в использовании для поиска снипов, чем bowtie (2-2.2.25) или Novoalign (3.02.12).

Использование Программный пакет BWA может быть использован в таких областях, как генотипирование для поиска однонуклеотидных полиморфизмов (снипов). Генотипирование позволяет проводить индивидуальное сравнение генотипов разных людей, с помощью него можно предсказывать предрасположенность людей к всевозможным заболеваниям, таким как, например, рак, диабет и многие другие. Так же пакет будет полезен в транскриптомике.

Начиная с версии 0.6.x, все алгоритмы могут работать с геномами, общая длина которых превышает 4 Гб. Тем не менее, размер индивидуальной хромосомы не должен превышать 2 Гб. Каждый алгоритм вызывается отдельной командой, принимает входной файл через стандартный поток ввода («stdin») и возвращает результат через стандартный поток вывода («stdout»).

BWA-BackTrack Сначала строится суффиксный массив, а затем генерируется BWT. Неопределённые нуклеотиды (обозначаются литерой «N») в референсном геноме преобразуются в случайные нуклеотиды, а в чтениях рассматриваются как несовпадения. Это может привести к регионам ложных совпадений («хитов») с неоднозначными основаниями. Но вероятность того, что это может произойти очень небольшая, учитывая относительно длинные чтения.

BWA-SW BWA-SW строит FM-индексы и для референсной последовательности и для чтений. Он неявно представляет собой референсную последовательность в виде префиксного дерева и чтения в виде детерминированного ациклического конечного автомата, который составляется из префиксного дерева для чтения с использованием динамического программирования. В отличие от BLAT и SSAHA2, BWA-SW находит сиды (от  — «семя»; точное совпадение нескольких пар оснований чтения) в референсном геноме с помощью построения FM-индексов. Выравнивание расширяется тогда, когда сид имеет несколько вхождений в эталонной последовательности. Скорость достигается за счёт уменьшения ненужного расширения для высоко повторяющихся последовательностей. По сравнению со стандартным выравниванием Смита — Ватермана, временная сложность которого равна , BWA-SW имеет лучшую временную сложность так как он, как минимум, не медленнее, чем BWT-SW, сложность которого — . В BWA-SW два выравнивания считаются различными в том случае, если длина зоны перекрытия по запросу составляет менее половины длины более короткого сегмента запроса.

Реализация BWA-SW принимает индекс BWA и FASTA запроса или FASTQ файла в качестве входных данных и выводит выравнивание в формате SAM. Входной файл, как правило, содержит много последовательностей («ридов»). Каждая последовательность обрабатывается, в свою очередь, с использованием нескольких потоков (если это возможно). Использование памяти при работе с данным алгоритмом составляет около 5 Гб для индексирования полных последовательностей генома человека. Для коротких прочтений требуется приблизительно 3,2 Гб при использовании команды aln и 5,4 Гб при использовании sampe. Необходимый объём памяти для каждого запроса примерно пропорционален длине последовательности. Кроме того, BWA-SW способен обнаружить химеру, потенциально вызванную структурными изменениями или эталонными ошибками сборки ридов, которые могут представлять угрозу для BLAT и SSAHA2. BWA-SW отличается от BWT-SW в нескольких аспектах: BWT-SW гарантирует, что найдёт все локальные совпадения, в то время как BWA-SW представляет собой эвристический алгоритм, который может пропустить истинные совпадения, но работает гораздо быстрее.

BWA-MEM BWA-MEM является последним реализованным алгоритмом пакета BWA. Он использует стратегию, в которой алгоритм выравнивания прочтений выбирается автоматически в каждом конкретном случае: локальное или глобальное выравнивание. Поддерживаются парноконцевые прочтения и выравнивания химерных прочтений. Алгоритм устойчив к ошибкам секвенирования и применим к широкому диапазону последовательности длиной от 70 п.о. до нескольких мегабаз. А для картирования последовательностей длинной 100 п.о. BWA-MEM показывает лучшую производительность, чем некоторые передовые алгоритмы выравнивания прочтений.

Показатели качества Для каждого выравнивания программный пакет BWA вычисляет оценку качества картирования — Phred масштабированную вероятность того, что выравнивание является некорректным ( — оценка качества прочитанного нуклеотида ДНК). Необходимость статистической оценки картирования возникает из-за того, что риды получаются маленькие (40—100 п.о), а геномы достаточно большие, поэтому выравниваний может быть несколько. Тем не менее, необходимо понять, какое из них наиболее информативное. И по сути Phred-оценка представляет собой вероятность того, что рид выравнен неправильно. Вычисляется она по формуле , где q — качество прочтения рида. Алгоритм аналогичен оценке для MAQ, за исключением того, что в BWA предполагается, что истинное совпадение всегда может быть найдено. Такое изменение было сделано в связи с тем, что формула MAQ переоценивает вероятность пропуска истинного совпадения, что приводит к заниженному качеству картирования. Моделирование показывает, что BWA может переоценивать качество картирования из-за этой модификации, но отклонение относительно невелико.

Примеры Пример сценария использования программного пакета BWA от Голландского вычислительного центра выглядит следующим образом:

Шаг 1 — индексирование генома (∼3 CPU часа для генома человека) bwa index -a bwtsw ref.fa ,где ref.fa — название файла с референсным геномом. Шаг 2а — генерирование выравнивания в координатах суффиксного массива bwa aln ref.fa read1.fq.gz > read1.sai bwa aln ref.fa read2.fq.gz > read2.sai ,где read1.fq.gz — файл с прямыми чтениями, read2.fq.gz — обратными чтениями. Применяем параметр -q15, если качество меньше на 3’-концах чтений. Шаг 3а — генерирование выравнивания в SAM формате для парноконцевых чтений bwa sampe ref.fa read1.sai read2.fq.gz > aln.sam Шаг 4a — генерирование выравнивания в SAM формате для непарноконцевых чтений bwa samse ref.fa read1.sai read1.fq.gz Шаг 2б — BWA-SW для длинных чтений bwa bwasw ref.fa long-read.fq.gz > aln-long.sam ,где long-read.fq.gz — файл с длинными чтениями.

Для дальнейшей совместимости полученного выравнивания со стандартными программами для анализа NGS данных, таких как, например, Pikard Tools или GATK, при вызове программы следует указывать так называемую группу прочтения ( — набор данных, полученных с помощью одного режима работы секвенсора) добавлением флага -r. Сама группа прочтения для образца с платформы Illumina-SOLEXA выглядит примерно следующим образом: -r ‘@RG\tID:1\tSM:S000336\tPL:ILLUMINA\tLB:L00000336\t PU:C3A7NACXX:1’, где ID — это уникальный идентификатор данного образца, SM — это названия образца, Pl — это платформа для секвенирования, LB — название библиотеки, а PU — системный идентификатор.

Практическое значение На практике BWA является основным инструментом, предназначенным для выравнивания коротких ридов. В настоящее время BWA применяется в следующих исследованиях:

Секвенирование и сборка генома. Поиск однонуклеотидных полиморфизмов. Поиск делеций и вставок.

Основными преимуществами использования программного комплекса BWA являются следующие его достоинства:

Высокая скорость работы Небольшие затраты по памяти. Простой интерфейс. При тонкой настройке лучшие статистические параметры

Также BWA входит в состав самых широко используемых биологических конвейеров не только в научной деятельности, но и в клинической:

GATK AMAP SPAdes

Примечания

Литература

Категория:Биоинформатика Категория:Геномика Категория:Методы биологических исследований