Поиск сайтов связывания транскрипционных факторов in silico

Поиск сайтов связывания транскрипционных факторов in silico — поиск и предсказание сайтов связывания факторов транскрипции в последовательности нуклеотидов ДНК при помощи компьютерных алгоритмов. Сайты связывания представляют собой короткие сегменты ДНК, длиной от 8—10 до 16—20 пар оснований, имеющие высокое сродство к факторам транскрипции. Эти короткие последовательности ДНК называются мотивамиBoeva V. «Analysis of Genomic Sequence Motifs for Deciphering Transcription Factor Binding and Transcriptional Regulation in Eukaryotic Cells» . Frontiers in Genetics. 2016;7:24. doi:10.3389/fgene.2016.00024.Tran, N. T. L., and Huang, C.-H. (2014). «A survey of motif finding Web tools for detecting binding site motifs in ChIP-Seq data» . Biol. Direct 9:4. doi: 10.1186/1745-6150-9-4Das MK, Dai H-K. «A survey of DNA motif finding algorithms.» BMC Bioinformatics. 2007;8(Suppl 7):S21. doi:10.1186/1471-2105-8-S7-S21.. Аналогично при помощи компьютерных алгоритмов ищутся сайты связывания кофакторов, полимераз, сайты сплайсинга и повторяющиеся элементы в ДНК. Обнаружение мотивов позволяет лучше понять регуляцию транскрипции, сплайсинг мРНК и образование белковых комплексов.

Способы представления мотивов

Консенсус Одним из популярных способов представления мотива является консенсус — слово, составленное из обозначений нуклеотидов, наиболее часто встречающихся в конкретных позициях сайта. Для записи консенсуса могут использоваться обозначения нуклеотидов в соответствии с номенклатурой ИЮПАК .

Например, для последовательностей вида: TACGAT TATAAT TATAAT GATACT TATGAT TATGTT

консенсус ИЮПАК будет выглядеть следующим образом:

TATRNT

Когда консенсус нестрогий, представление мотива может включать в себя экземпляры с очень низкой аффинностью связывания. С другой стороны, очень строгий консенсус может не охватить все реально существующие вариации мотива .

Позиционная весовая матрица (ПВМ)

Вторым наиболее популярным методом является использование позиционной весовой матрицы (ПВМ). ПВМ построена на основе частот единичных нуклеотидов (A, T, G, C). Использование ПВМ позволяет отличить сильные сайты связывания от слабых сайтов связывания, но возникает проблема отделения слабых мотивов от фона. Недостатком также является то, что ПВМ не учитывает взаимосвязи позиций внутри мотива (позиции считают независимыми друг от друга). Однако существует динуклеотидная ПВМ, использующая 16-буквенный алфавит (AA, AC, AT, …..., CG, GG). Использование динуклеотидных ПВМ позволяет учитывать взаимосвязи между соседними нуклеотидами . Эта модель реализована в методах обнаружения мотивов Dimont и diChIPMunk .

Методы контролируемой классификации Модели, использующие байесовские сети, позволяют установить зависимости между позициями внутри мотива, однако не существует простого способа визуализировать эти мотивы. Существуют также методы построения мотивов с использованием графов (например, скрытые марковские модели) или с использованием метода опорных векторов. Подобные методы позволяют искать мотивы со спейсерами — участками вариабельной длины между двумя полусайтами двойных мотивов (каждый полусайт представляет собой участок посадки одной из субъединиц димера транскрипционного фактора) . Основные задачи В анализе геномных последовательностей при поиске мотивов выделяют две ключевые задачи:

Идентификация в наборе последовательностей ДНК уже известных мотивов из баз данных; Обнаружение неизвестных мотивов de novo. Задача актуальна, когда есть набор промоторных последовательностей с предполагаемым общим транскрипционным фактором, но сам фактор транскрипции или сайты связывания для фактора транскрипции неизвестны.

Поиск мотивов на основе уже известных Сканирование набора последовательностей против известных мотивов помогает идентифицировать совместно регулирующиеся гены с общими факторами транскрипции или оценить влияние мутаций в последовательности мотива на связывание с транскрипционным фактором.

Информация о сайте связывания транскрипционных факторов в последовательностях ДНК получается экспериментально такими методами, как SELEX, РВМ (protein binding microarrays) или -х (то есть, ChIP-seq, ChIP-exo, ORGANIC, ChIP-on-chip. Полученные в результате экспериментов последовательности сайтов связывания описываются моделью (мотивом). На данный момент уже известно много мотивов, собранных в различные базы данных. Каждое обнаруженное в последовательности ДНК совпадение с последовательностью мотива из базы данных именуется экземпляром мотива (хитом) или словом.

Сложности в идентификации мотивов:

Точная последовательность мотива может быть неизвестна, так как в ней могут происходить мутации; В интересующей последовательности может находиться несколько мотивов (например, сайт связывания транскрипционного фактора и сайт связывания его кофактора), или только один мотив, или же, наоборот, ни одного; Мотивы могут перекрываться; Неизвестно, где находится мотив относительно точки старта транскрипции; Необходимы критерии для отделения настоящих мотивов от шума.

На данный момент существует множество подходов для поиска мотивов. Каждый метод имеет свои ограничения и какого-либо универсального алгоритма не существует. Лучшим решением для предсказания мотивов считается использование комбинированных подходов.

Поиск мотивов de novo Когда позиционная весовая матрица (ПВМ) сайта связывания интересующего фактора транскрипции неизвестна, она может быть получена путем обнаружения мотивов de novo из набора последовательностей ДНК, содержащих сайты связывания этого фактора транскрипции. Методика состоит в определении наиболее перепредставленных (т.е. встречающихся чаще, чем можно ожидать случайно) мотивов в данном наборе последовательностей ДНК. Существует большое количество de novo методов обнаружения перепредставленных мотивов. Несколько методов были созданы для анализа больших наборов последовательностей в результате ChIP-seq экспериментов: HMS, cERMIT, ChIPMunk, diChIPMunk, MEME-ChIP, POSMO, XXmotif, FMotif, Dimont, RSAT, and DeepBind. Проверка обнаруженных сайтов связывания транскрипционного фактора может быть осуществлена с использованием комбинации иммунопреципитации хроматина с антителом, специфичным к интересующему фактору транскрипции, и полимеразной цепной реакции в реальном времени с праймерами, специфичными к предсказанному целевому региону.

Классификация алгоритмов Алгоритмы можно классифицировать на основе исследуемых последовательностей и по принципу действия.

По набору исследуемых последовательностей Алгоритмы поиска мотивов по типам входных данных можно разделить на три основных класса:

использующие промоторные последовательности совместно регулируемых генов из одного генома и поиск статистически перепредставленых мотивов; использующие ортологичные промоторные последовательности одного гена у нескольких видов (т.е. ), например, PHYLONET, PhyloScan и PhyloCon; использующие комплексный подход, т.е. последовательности промоторов совместно регулируемых генов и филогенетический футпринтинг.

Более ранние алгоритмы используют промоторные последовательности совместно регулируемых генов из одного генома и поиск статистически перепредставленых мотивов. В настоящее время появляются алгоритмы для использования филогенетического футпринтинга или ортологичных последовательностей, а также разрабатывается комплексный подход, при котором используют промоторные последовательности совместно регулируемых генов и филогенетический футпринтинг.

По принципу действия По принципу действия выделяют следующие:

методы, основанные на операциях со строками (словами), которые в основном полагаются на подсчет и сравнение частот олигонуклеотидов. К ним относятся методы, использующие суффиксные деревья, и методы на основе графов; вероятностные модели последовательности, где параметры модели оцениваются с использованием принципа максимального правдоподобия, байесовских сетей.

Такие методы k-мерного перечисления, как POSMO, cERMIT, и RSAT-peak-motifs, показывают очень конкурентоспособное время выполнения задачи на больших наборах данных ChIP-seq. Тем не менее, вероятностные подходы (например, ChIPMunk, Dimont) могут обеспечить большую точность результатов.

Строковые методы Строковые методы подсчитывают количество совпадений в последовательности всех возможных мотивов, представленных регулярными выражениями, и вычисляют, какие из них встречаются чаще. Строковые методы подходят для поиска коротких эукариотических мотивов, которые обычно короче, чем у прокариот и для поиска очень консервативных последовательностей. Время работы этих алгоритмов экспоненциально растет с длиной искомого мотива, однако они могут быть достаточно быстры, если реализованы с помощью структур оптимизированных данных, таких как деревья суффиксов (алгоритмы Weeder и MITRA (Mismatch Tree Algorithm) или графы (алгоритм WINNOWER). Плюсом является также то, что строковые методы находят глобальный оптимум, поскольку перебирают все подстроки в исследуемых последовательностях. Однако типичные мотивы транскрипционных факторов часто имеют слабо консервативные позиции. Недостатком методов также является нахождение большого количества ложных мотивов.

В данном типе методов можно выделить несколько классов:

Полное перечисление; Кластерные методы; Методы, основанные на использовании деревьев; Методы, основанные на использовании графов; Методы, использующие хэширование; Методы фиксированных кандидатов.

Вероятностный подход Вероятностный подход предполагает представление модели мотива с помощью позиционной весовой матрицы (ПВМ). Вероятностные методы подходят для поиска более длинных мотивов как для прокариот, так и для эукариот. Эти алгоритмы, в отличие от алгоритмов строкового метода, не ищут оптимальное глобальное решение и используют локальные методы поиска, такие как:

Сэмплирование по Гиббсу (AlignACE, ANN-Spec, BioProspector, MotifSampler, GLAM, SeSiMCMC, PhyloGibbs, GibbsST); Принцип максимального правдоподобия (MEME, MEME-ChIP, LOGOS, Improbizer, PhyME, OrthoMEME, GIMF); Жадный алгоритм (ChIPmunk и diChIPMunk).

Эти алгоритмы также можно разделить на несколько классов:

Детерминистические методы, основанные на принципе максимального правдоподобия (MEME, STEME, EXTREME) Стохастические методы, основанные на сэмплировании по Гиббсу (AlignACE, BioProspector) Байесовские методы (LOGOS)

Подходы, основанные на природных механизмах Генетический алгоритм, муравьиный алгоритм, методы роя частиц, алгоритм пчелиной колонии, алгоритм кукушки также применяются для оптимизации поиска мотивов. Алгоритмы поиска мотивовПодходПринцип поискаПримерыСтроковыйДеревья суффиксовSMILE, VerbumculusСтроковыйДеревья префиксов/ГрафыMITRAСтроковыйГрафыWINNOWERСтроковыйПолное перечислениеYMF, Oligo-Analysis, WeederСтроковыйСловарьMobyDick, WordSpyВероятностныйСэмплирование по ГиббсуSeSiMCMCВероятностныйПринцип максимального правдоподобияMEME, PhyMEВероятностныйЖадный алгоритм ChIPMunk, MDScanФилогенетический футпринтингВыравнивание последовательностейPHYLONETПрочиеГенетический алгоритм, КластеризацияGAME, FMGA, EMD

Инструменты поиска The MEME Suite — программный пакет инструментов с единым веб-интерфейсом для поиска и анализа мотивов в ДНК, РНК и белковых последовательностях, также существует локальная версия (не все инструменты доступны в виде веб-сервисов). MEME использует вероятностную и дискретную модели для поиска безделеционных мотивов и не предназначен для поиска мотивов в больших наборах данных. Алгоритм GLAM2 (Gapped Local Alignment of Motifs) позволяет учитывать вставки и делеции в мотивах.