VHL (сокр. от ), также опухолевый супрессор VHL или pVHL — белок-онкосупрессор (антионкобелок), который кодируется одноимённым геном VHL, расположенным на коротком плече (p-плече) 3-й хромосомы. Мутация гена VHL связана с аутосомно-доминантным заболеванием — болезнью Гиппеля—Линдау. Большинство спорадических светлоклеточных карцином почек характеризуются инактивацией гена-онкосупрессора VHL.
Белок состоит из остатков 213 аминокислот, а его молекулярная масса составляет .
Аббревиатура белка VHL происходит от сокращения названия болезни (von Hippel-Lindau). Впервые название данного белка было использовано в мартовском номере 1988 года журнала Nature, в статье исследователями Bernd Seizinger и его сотрудниками. В ней описывалось влияние патогенного белка VHL на онкогенез и был установленно расположение предполагаемого патогенного гена в локусе 3p25.
Структура гена Ген VHL у человека локализуется на 3-й хромосоме в локусе 3p26-p25. Ген VHL включает в себя 3 экзона и 642 пары нуклеотидов ДНК.
Два из стартовых кодонов гена в первом экзоне приводят к экспрессии двух форм белка VHL. Первый экзон насчитывает 213 пар нуклеотидов, которые транскрибируются на молекулу мРНК, начиная с первого стартового кодона, тогда как второй стартовый кодон находится в положении 54 и предшествует кодирующей последовательности инициации трансляции. Транскрипция гена из этого исходного сайта и трансляция мРНК приводят к синтезу белка VHL1, состоящего из 160 аминокислот, обозначенного VHL19, в отличие от первой формы белка с более высокой молекулярной массой — VHL30. Было обнаружено, что изоформы VHL30 в основном локализуются в цитоплазме, а изоформа VHL19 — в клеточном ядре; это указывает на то, что выполняемые функции данных белков не идентичны. В одном исследовании присутствие pVHL в митохондриях было продемонстрировано с помощью меченых GFP антител. Когда молекулярная масса не имеет отношения к описанию функции белка, то используется обозначение pVHL.
Было обнаружено, что транскрипт pVHL мРНК альтернативно сплайсирован, что выражается в наличии в клетке двух изоформ мРНК, одна из которых имеет экзон 2, а другая без экзона. Поскольку люди с мутированным геном VHL лишены экзона 2 и имеют ярко выраженные симптомы болезни von Hippel—Lindau, то похоже, что только более длинная белковая изоформа действует как супрессор. До сих пор не доказано, что альтернативные сплайсирующие мРНК являются трансляционными in vivo.
Промоторная последовательность гена VHL богата репликатами GC, не имеет ТАТА-бокса и CCAAT-последовательности; инициация транскрипции, вероятно, происходит в точке, предполагающей связывание белка Sp1, 60 пар оснований в направлении 5'-конца нити ДНК от первого стартового кодона VHL. Последовательность промотора имеет множество предсказуемых сайтов для связывания факторов транскрипции, но до сих пор не был идентифицирован механизм контроля экспрессии гена VHL. Последовательность кодирования гена предшествует 3’UTR-области, имеющей 11 повторов Alu.
Экспрессия гена Экспрессия гена VHL не ограничена органами, из которых развиваются опухоли при болезни von Hippel—Lindau. Она происходит во многих типах клеток как у плода, так и у взрослых организмов. В ходе эмбриогенеза мРНК гена VHL была обнаружена практически во всех типах тканей с 6-й недели жизни. Но особенно большое количество молекул мРНК VHL было найдено в тканях урогенитального тракта, головного мозга, спинного мозга, спинальных ганглиях, глазного нерва и эпителия бронхов. Распределение усиленной экспрессии гена VHL совершенно точно не соответствует тканям при болезни von Hippel—Lindau. В развивающейся нормальной почке (метанефрос) VHL экспрессируется в проксимальной канальце (из которого возникает карцинома почки), но белок pVHL в изобилии синтезируется в петле Генле. Нет никаких свидетельств различий в экспрессии двух форм белка VHL19 и VHL30 между различными тканями плода.
Функции
Белок pVHL воздействует на клетки в комплексе, состоящем из многочисленных белков, которые прямо или косвенно взаимодействуют с ним, посредством образования связей. На сегодняшний день известно, что эта группа белков включает:
элонгин C и элонгин B, CUL2 и Rbx1 (также называемый ROC1 или Hrt1); В комплекс также входит ацетилтрансфераза SSAT2; HIF-1; фибронектин; тубулин-формирующие микротрубочки; sp1 транскрипционный фактор; протеинкиназы C (PKC-δ изотипы, PKC-ζ и PKC-λ); белки из семейства деубиквитинизирующих ферментов, VDU1 и VDU2 (VHL-взаимодействующий деубиквитинирующий фермент-1/2); белок-онкосупрессор P53; гиперфосфорилированный Rpb1-белок, субъединицы РНК-полимеразы II; имидопептидаза, которая прикрепляется к N-концу белка в аминокислотных остатках 1-57; Tat 1 связывающий белок (белок Tat 1 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1)) прикрепляется к области pVHL 1: 87; Филамин (актинсвязывающий белок, АБП) также прикрепляется к этой области.
При высоких концентрациях в клетке молекулы белка pVHL могут связываться друг с другом через аминокислотные остатки 96-122, но не было продемонстрировано, чтобы молекулы pVHL связывались друг с другом при физиологических (нормальных) концентрациях.
Основные функции, выполняемые белком pVHL:
в комплексе с элонгином C, элонгином B и куллином (CUL2) с активной убиквитинлигазы E3 в качестве субстратного белка участвует в убиквитинировании белка HIF1-α. Данный комплекс разрушает белок HIF1-α в протеасоме и ингибирует транскрипцию индуцированных гипоксией генов, активированных данным белком; ингибирование транскрипции определённых факторов роста (например, VEGF) через Sp1; модификация внутриклеточных сигнальных процессов, посредством ингибирования атипичных путей белка протеинкиназами PKC-δ, PKC-ζ и PKC-λ, а также путём убиквитинирования; при связывании с фибронектином pVHL может влиять на образование внеклеточного матрикса; связывание с тубулином из микротрубочек ингибирует их деполимеризацию; Эта функция pVHL не зависит от активности убиквитинлигазы Е3, входящей в комплекс VBC, потому что мутантный pVHL-белок, не имеющий элонгин С связывающего сайта, сохраняет способность стабилизации микротрубочек; Необъяснимым образом контролирует клеточный цикл; VHL-/- (не содержащие VHL) клетки не могут покинуть цикл после экспериментального ответа на такой фактор, как удаление сыворотки культуральной среды; Возможность выхода из клеточного цикла была восстановлена при введении pVHL; Контроль цикла с помощью pVHL проявляется многофакторно: два исследования показали, что pVHL ингибирует циклин D1, который является митогеном; В другом исследовании показано, что pVHL ингибирует TGF-α, ген которого недавно был идентифицирован как регулируемый белком HIF.
В одном исследовании было продемонстрировано, что pVHL связывается in vivo с белком P53, стабилизируя и предотвращая убиквитинирование P53 белком Mdm2; Кроме того, в условиях повреждения ДНК (генотоксический стресс) pVHL способствует взаимодействию белков P53 и P300 и последующему ацетилированию P53, что приводит к увеличению транскрипционной активности этого белка и эффективной остановки клеточного цикла и, как следствие к индукции апоптоза. По-видимому, это может быть искомый, нелетальный механизм действия HIF-α, в котором pVHL выполняет роль супрессорного белка. Важность взаимодействия pVHL с филамазой и ВИЧ-связывающим белком Tat неясна.
Регуляция функций В пределах нуклеотидной последовательности гена VHL было найдено несколько консенсусных киназных последовательностей, поэтому регулирование функции белка pVHL может основываться на киназном фосфорилировании. Недавно было показано, что VHL30 является субстратом для киназы 3 гликогенсинтазы (GSK3) in vitro и in vivo. Фермент фосфорилирует VHL30 по сериновому остатку 68; прежде белок должен быть фосфорилирован на серине 72, который in vitro катализирует казеинкиназу I. Как показано в той же работе, мутантный некиназный VHL30-белок не имеет функции стабилизации микротрубочек.
Эквиваленты гена VHL у животных
Генетическая последовательность VHL высоко консервативна у гомологичных человекообразных приматов и грызунов. Гомологичный ген был обнаружен у нематод Caenorhabditis elegans и в плодовой мушке. Сохранение последовательностей генов особенно велико в областях, связывающих домены с другими белками. Комплекс pVHL-элонгин B-элонгин С напоминает комплекс SCF у дрожжей, который проявляет функцию полиубиквитинирования белков посредством их протеолиза. Элонгин C и Cul2 представляют собой, соответственно эквивалентные дрожжевые белки Skp1 и Cdc53. Сходство этих белков было подтверждено позже предположением о том, что белковый комплекс pVHL функционирует в клетках человека как убиквитин-E3-лигаза. Область гена VHL между кодонами 14-53, кодирует восемь репликатов, содержащие кислые аминокислоты (с повышенным содержанием карбоксильных групп) [Gly-X-Glu-Glu-X]8 (GXEEX8), которая гомологична мембранному белку . Значение этого факта остается неизвестным.
Патологии, связанные с мутацией гена VHL +Разбивка мутации гена VHL при болезни Гиппеля—Линдау Общий объём описанной мутации 823 Сдвигов рамки считывания 297 (36,08 %) Делеции 235 (28,55 %) Инсерции 62 (7,53 %) Точечные мутации 496 (60,27 %) Миссенс-мутации 399 (48,48 %) Нонсенс-мутации 97 (11,79 %) G>A 29 G>A w CpG 42 C>T 65 C>T at CpG 57 A>T 10 A>G 20 A>C 17 T>G 20 T>C 76 T>A 29 C>A 30 C>G 47 G>T 41 G>C 29 Комплексные мутации 2 (0,24 %)
Гомозиготные мыши с VHL-/- живут 10,5-12,5 дней внутриутробной жизни; причиной выкидыша является нарушение вагулогенетики плаценты. Вероятно, это очень редкая мутация обоих аллелей VHL, которая у людей также препятствует раннему развитию эмбриона.
Как упоминалось ранее, мутация гена VHL у гетерозигот человека почти всегда вызывает болезнь von Hippel—Lindau. Клиническое распространение заболевания из-за частоты отдельных симптомов, особенно светлоклеточной карциномы почки и феохромоцитомы, коррелирует с характером мутации в гене VHL. Таким образом, большое количество делеций и преждевременное прекращение трансляции, приводящие к укороченной молекуле pVHL, характерны для заболевания типа 1, и точечные мутации, особенно миссенс, отвечают за тип 2. Известно более 500 различных мутаций зародышевой линии в гене VHL; все случаи новых мутаций сообщаются в международный реестр.
+ Клиническая классификация болезни von Hippel—Lindau Тип Тип мутации Молекулярный дефект HB R HB CNN RCC Pheo GEP 1 Делеции, нонсенс Гиперэкспрессия HIF и сверхэкспрессия генов ответа гипоксии + + + - - 2A Миссенс Гиперэкспрессия HIF и сверхэкспрессия генов ответа гипоксииДестабилизация микротрубочек + + - + + 2B Миссенс Гиперэкспрессия HIF и сверхэкспрессия генов ответа гипоксии + + + + + 2C Миссенс Нарушение ECM-образования фибронектиномМеханизм зависит от P53 (?) - - - +? HB R — гемангиомы сетчатки; HB CNN — гемангиомы центральной нервной системы; RCC — карцинома почек; Pheo — феохромоцитома; GEP — нейроэндокринная опухоль поджелудочной железы
Соматические мутации в гене VHL также обнаружены в спорадических опухолях почек и зародышевых клетках. Соматическая мутация гена VHL встречается примерно в 50 % случаев спорадического рака почки, и примерно в 10-20 % ген гиперметилируется. Сообщалось также о 30 % случаев спорадических эмбриональных аномалий, но гиперметилирование VHL до сих пор не обнаруживалось в опухолевых клетках. LOH (сокр. от — утрата гетерозиготности) гена VHL описана в спорадических панкреатических микрососудистых аденомах и эндотелиальных опухолях (ELST). Мутации VHL встречаются редко при спорадической феохромоцитоме и очень редки в других формах рака: лёгких, молочной железы, яичника, яичек, шейки матки, эндометрия, простаты, колоректальный рак, карцинома мочевого пузыря, рака кожи (злокачественная меланома), плевральной карциномы, плоскоклеточной карциномы полового члена и фолликулярного рака щитовидной железы.