Сборка транскриптома de novo — метод сборки последовательностей транскриптома, который осуществляется без картирования на референсный геном. Из коротких фрагментов (ридов или прочтений), полученных при секвенировании, воссоздаются отдельные последовательности РНК или транскрипты.
Введение В период с 2008 по 2018 год в связи с разработкой новых технологий произошло значительное снижение стоимости секвенирования. До технологического прорыва секвенирование транскриптомов производилось только для тех организмов, которые представляли большой интерес для научных исследований. Однако с развитием технологий секвенирования следующего поколения и методов RNA-seq стало возможно секвенировать транскриптомы сложных, полиплоидных немодельных организмов. Создание сборок de novo для модельных организмов полезно для обнаружения новых изоформ существующих аннотированных генов, альтернативных событий сплайсинга и новых транскрибируемых генов в ответ на специфическое воздействие.
Сборка транскриптома vs. сборка генома Геномы большинства организмов сложны для сборки из-за большого размера, а также повсеместно встречающихся повторов. Транскриптомы же организмов, состоящие из последовательностей РНК, из которых в процессе сплайсинга вырезаются интроны, гораздо меньше по размеру и количеству повторов. Поэтому гораздо дешевле секвенировать транскриптом, чем геном. Последовательность генома — эта наиболее полная информация об организме, однако реализация генетической программы порой гораздо важнее и интереснее, чем сама программа. Поэтому узнать о том, какие участки генома транскрибируются и какие продукты они дают, можно при помощи технологии секвенирования RNA-seq. Транскриптомные данные почти всегда необходимы для точной аннотации генома. Что касается технической стороны обработки данных, алгоритмы сборки геномов плохо работают в случае неравномерного покрытия ридами, а в случае транскриптома гены могут иметь очень разное покрытие из-за разницы в уровнях эксрессии.
De novo сборка транскриптома vs. сборка транскриптома с использованием референсной последовательности De novo сборка транскриптома не требует наличия референсного генома. Учитывая, что большинство организмов на данный момент еще не отсеквенированы, de novo сборка транскриптома таких организмов может быть использована как первый этап в их изучении. Например, для изучения и сравнения транскриптомов между организмами, а также для анализа дифференциальной экспрессии при различных воздействиях на организм. Иногда бывает полезно собирать транскриптом de novo даже при наличии референсного генома, так как при этом можно обнаружить транскрибируемые участки, последовательности которых отсутствуют в геномной сборке. Имея de novo сборку и референсный геном можно детектировать транскрипты экзогенного происхождения. Самое важное отличие de novo сборки в том, что при этом не требуется выравнивать последовательности и решать проблемы поиска или предсказания сайтов сплайсинга, помимо этого удается собирать транскрипты, полученные в результате транссплайсинга. Однако сборка de novo является алгоритмически сложным и вычислительно затратным процессом. Также данный подход отличается высокой чувствительностью к ошибкам.
Этапы сборки транскриптома de novo
Экспериментальная часть Для секвенирования транскриптома используются стандартные протоколы подготовки образцов, в ходе которых выделяют все возможные последовательности РНК (тотальная РНК), уменьшают количество рибосомной РНК, производят обратную транскрипцию, фрагментируют кДНК, лигируют адаптеры, амплифицируют и секвенируют короткие фрагменты кДНК.
В случае de novo сборки транскриптома важно принимать во внимание некоторые особенности пробоподготовки. Во-первых, в одном организме транскриптом клеток может значительно различаться в зависимости от ткани, времени взятия образца, а также наличия того или иного стресса. Для сборки транскриптома de novo неизвестного организма необходимо иметь информацию о всех экспрессирующихся генах. Для этого необходимо секвенировать как можно больше органов и тканей в условиях различных стрессов. Во-вторых, так как гены различаются по уровню экспрессии, то в составе тотальной РНК одних транскриптов будет больше, а других меньше. Соответственно больше всего ридов будет получено от высокоэкспрессирующихся генов, в то время как низкоэкспрессирующиеся гены могут быть неотсеквенированы. Из этого вытекает еще одна особенность сборки транскриптома de novo: глубина секвенирования должна быть довольно высока, чтобы детектировать даже низкоэкспрессирующиеся гены. Существует экспериментальная процедура нормализации библиотеки кДНК, которая позволяет увеличить среднее покрытие. Этот метод основан на действии дуплекс-специфической нуклеазы. При этом молекулы кДНК, полученные в ходе обратной транскрипции, нагревают, чтобы они денатурировали. При ренатурации одноцепочечные молекулы кДНК высокоэкспрессированных транскриптов быстрее образуют дуплексы, которые затем расщепляются специальной нуклеазой. Так уменьшается количество кДНК высокоэкспрессируемых генов и увеличивается вероятность, что при данной глубине секвенирования получится увеличить покрытие низкоэкспрессируемых генов.
Предобработка данных секвенирования
Оценка качества и триммирование ридов В процессе секвенирования могут возникать ошибки при прочтении.
Качество секвенирования оценивается с помощью метрики Phred quality score (Q score). Она рассчитывается для каждого нуклеотида по формуле , где P — это вероятность ошибки. При Q > 20 можно говорить о хорошем качестве прочтения нуклеотида, то есть вероятность того, что он неверно отсеквенирован составляет 1 %. Первичный анализ данных секвенирования (QC report) проводится в программе FastQC. Далее по порогу Q score можно отсекать нуклеотиды с низким качеством с концов прочтения (там качество заметно ниже), а также удалять последовательности адаптеров. Эта процедура называется триммированием.
«Цифровая» нормализация Проблема перепредставленности некоторых транскриптов и, соответственно, проблема неравномерности покрытия решается не только с помощью экспериментальной процедуры, но и методом цифровой нормализации (digital normalization). При этом создается хеш-таблица : последовательность k-мера и его представленность (количество во всех ридах). Далее на основании этой таблицы для каждого рида рассчитывается медианное значение покрытия по k-мерам, из которых он состоит. Устанавливается порог по покрытию, по которому прочтения с медианным значением выше данного отбрасываются. Таким образом удаляются риды с очень большим покрытием.
Алгоритмы сборки транскриптома Алгоритмы сборки транскриптома de novo очень схожи с таковыми для сборки генома. Их можно разделить на две группы:
overlap-layout-consensus (OLC) алгоритмы. Они чаще применяются для длинных фрагментов. алгоритмы, основанные на графах де Брёйна или De Bruijn graph (DBG). Они чаще применяются для коротких фрагментов.
В отличие от сборки генома, при сборке транскриптома возникает задача восстановить множество нуклеотидных последовательностей, имеющих различную длину, а не одну исходную последовательность.
Overlap-layout-consensus(OLC)-алгоритмы Алгоритмы OLC работают непосредственно с ридами и производят с ними следующие операции:
Первый шаг: поиск пересекающихся (overlapping) ридов Второй шаг: построение графа, в вершинах которого находятся сами прочтения, а ребра отражают перекрытия. Третий шаг: поиск контигов — неразветвленных путей в построенном графе перекрытий. Этот шаг подразумевает поиск Гамильтонова пути — пути, содержащего каждую вершину графа ровно один раз, что является NP-сложной задачей и не позволяет работать на больших графах. Четвертый шаг: построение множественного выравнивания по попарным выравниваниям фрагментов и определение консенсусной последовательности.
OLC подходы были разработаны для сборки длинных прочтений, созданных по методике Сэнгера, и были широко распространены до появления секвенирования следующего поколения. Сейчас однако есть популярные пакеты, использующие данные алгоритмы для сборки транскриптомных и геномных последовательностей.
Алгоритмы на графах де Брёйна (DBG) С развитием технологий секвенирования следующего поколения, получение фрагментов (ридов) стало на порядок дешевле, но размер фрагментов стал меньше. Для сборки из коротких прочтений было предложено использовать графы де Брёйна. Вершинами графа де Брёйна являются возможные k-меры (строки длины k), выделенные из исходных прочтений. Два k-мера, соединяются в графе ребром, если они являются префиксом и суффиксом k+1-мера, также представленного в исходных прочтениях. Ребром является k+1-мер.
Оптимальное значение k для сборки зависит от длины прочтения, глубины секвенирования, частоты ошибок и сложности транскриптома конкретного вида. Для низкоэкспрессируемых генов с маленьким покрытием, для которых риды слабо перекрываются для улучшения качества сборки подходит уменьшенное значение k. В то время как большие значения k позволяют разрешать повторы и участки с ошибками. Оптимальные значения k лежат в пределе от 21 до 50.
Далее производятся четыре типа упрощений графа: сжатие путей, удаление ошибок, раздвоение вершин, из которых выходит несколько ребер и, если доступны парные чтения, разрешение небольших повторов. После этого риды накладываются на граф де Брёйна и происходит восстановление последовательностей контигов: при этом последовательно обходят все ребра графа.
Разрешение повторов
После построения графа требуется провести дополнительные процедуры по разрешению повторов. Повтор в транскриптоме изменяет граф де Брёйна, склеивая участки графа, соответствующие различным транскриптам. Разрешение повторов — это этап, на котором происходит попытка определить, какой путь в графе на самом деле содержит повтор. Затем происходит разделение повтора, при котором создаётся по копии повтора для каждого истинного пути.
Рассмотрим пример повтора в графе де Брёйна, представленном на Рисунке 1. Сборщик использует информацию об имеющихся ридах, чтобы оценить возможность существования каждого из четырёх вариантов. Длинный рид r1 позволяет однозначно определить, что повтор имеется в последовательностях ARB и CRD, а не в ARD и CRB. Об этом же свидетельствуют риды r5 и r6. Короткие риды r2, r3, r4 не позволили бы однозначно разрешить повтор. Чем длиннее риды, тем больше повторов мы сможем разрешить. Однако при секвенировании следующего поколения получаются короткие риды. Возможность разрешить повторы появляется при использовании парных ридов.
Альтернативный сплайсинг События альтернативного сплайсинга существенно усложняют процесс сборки, причем как de novo, так и при наличии референсной последовательности. Процедура определения истинных изоформ осуществляется уже после сборки контигов. Как и в случае повторов парные чтения дают ключевую информацию о возможных изоформах. Эту информацию удобно представлять в виде сплайс-графов, в вершинах которых находятся экзоны, а ребра отображают возможные соединения между ними.
Сравнение OLC и DBG Алгортимы, основанные на перекрывании ридов, менее чувствительны к ошибкам, однако для построения графа требуется больше вычислительной мощности. На время построения графа чтений негативно влияет число, а не длина ридов. Ключевой параметр данных алгоритмов — длина перекрытия.
Алгоритмы, основанные на графах де Брейна, очень чувствительны к повторам и ошибкам в чтениях. Одна ошибка в чтении создает k ошибочных узлов. Использование этих алгоритмов позволяет экономить память (большинство k-меров встречается во многих ридах). Также упрощается работа с повторяющимися участками. Помимо этого есть возможность отсеивать ошибки уже на начальной стадии обработки данных. Ключевой параметр данных алгоритмов — k, длина k-мера.
Оценка качества сборки