Транскрипто́мные техноло́гии () — методы, разработанные для изучения транскриптома (то есть совокупности всех РНК-транскриптов) организма. В состав транскриптома входят все транскрипты, которые присутствовали в клетке на момент . Исследуя транскриптом, можно установить, какие клеточные процессы были активны в тот или иной момент времени.

Первые попытки изучения транскриптома были предприняты в начале 1990-х годов. Благодаря развитию новых технологий в конце 1990-х транскриптомика стала важной биологической наукой. В настоящий момент в транскриптомике есть два основополагающих метода: микрочипы, позволяющие выявить наличие и количество определённых транскриптов, и секвенирование РНК (РНК-Seq), в котором используются методы секвенирования нового поколения для получения последовательностей всех транскриптов. С улучшением методик количество данных, получаемых в ходе одного транскриптомного эксперимента, увеличивалось. В связи с этим методы анализа данных также совершенствовались, чтобы обеспечить точный и эффективный анализ возрастающего объёма данных. Транскриптомные базы данных постоянно растут и становятся всё более полезными для исследователей. Это связано с тем, что правильная интерпретация данных, полученных в ходе транскриптомного эксперимента, практически невозможна без опоры на предшествующие исследования.

Измерение уровня экспрессии определённых генов в клетках разных тканей и при разных условиях или же в разные моменты времени даёт информацию о регуляторных механизмах, связанных с экспрессией генов. С помощью этих данных могут быть определены функции ранее генов. Анализ транскриптомов позволяет выявить различия в экспрессии определённых генов у разных организмов, что может быть особенно полезно для понимания молекулярных основ заболеваний человека.

История

Первая попытка получения части человеческого транскриптома была предпринята в 1991 году; в ходе этого исследования были получены последовательности 609 мРНК из мозга человека. В 2008 году были опубликованы два человеческих транскриптома, состоящие из миллионов последовательностей, происходящих от транскриптов 16 тысяч генов. К 2015 году были опубликованы транскриптомы сотен людей. Получение транскриптомов индивидуумов с тем или иным заболеванием, разных тканей и даже одиночных клеток в настоящее время является рутинной процедурой. Бурное развитие транскриптомики было возможно благодаря быстрому развитию новых экономичных технологий с повышенной чувствительностью.

До транскриптомики Исследования отдельных транскриптов проводились ещё за несколько десятилетий до того, как методы транскриптомики стали общедоступны. В конце 1970-х были получены , которые были конвертированы в комплементарную ДНК (кДНК) с помощью обратной транскриптазы для бабочки . В 1980-х с помощью низкопроизводительного секвенирования по Сэнгеру были получены последовательности случайных транскриптов; так появились так называемые (). Метод секвенирования по Сэнгеру доминировал до появления технологий высокопроизводительного секвенирования, например, секвенирования синтезом (Solexa/Illumina). EST стали активно использоваться в 1990-х как эффективный метод определения генного состава организма без . Количество отдельных транскриптов оценивалось с помощью нозерн-блотов, и количественной ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR). Однако эти методы очень трудоёмки и охватывают лишь крошечную долю целого транскриптома.

Первые попытки Слово «транскриптом» () было введено в употребление в 1990-х годах. В 1995 году появился первый транскриптомный метод, основанный на секвенировании, — (), который заключался в секвенировании по Сэнгеру соединённых фрагментов случайных транскриптов. Количество транскриптов оценивалось по числу совпадений с фрагментами известных генов. Вскоре появился вариант SAGE, использующий вместо секвенирования по Сэнгеру технологии секвенирования нового поколения — цифровой анализ экспрессии генов (). Однако эти методы практически полностью были вытеснены методами высокопроизводительного секвенирования целых транскриптов, которые давали дополнительную информацию о транскрипте, например, сведения о сплайсинговых вариантах.

Развитие современных методов + Сравнение современных методовРНК-SeqМикрочипыОт 1 дня до 1 недели на эксперимент1—2 дня на экспериментНеобходимое количество РНКНизкое ~ 1 нг тотальной РНКВысокое ~ 1 мкг РНКТрудоёмкостьВысокая (пробоподготовка и анализ данных)НизкаяПредшествующая информацияНе требуется, хотя наличие /транскриптома упрощает работуДля создания необходим референсный геном/транскриптомТочность количественной оценки~ 90 % (ограничена последовательностей)> 90 % (ограничена точностью детекции флуоресценции)Разрешение последовательностейМожет детектировать однонуклеотидные полиморфизмы и сплайсинговые варианты (ограничение — точность секвенирования (~ 99 %))Специализированные микрочипы могут детектировать сплайсинговые варианты (ограничения — создание проб и кросс-гибридизация)Чувствительность1 транскрипт на миллион (приблизительно, ограничение — покрытие последовательности)1 транскрипт на тысячу (приблизительно, ограничено детекцией флуоресценции)Динамический диапазон100000 : 1 (ограничен покрытием последовательности)1000 : 1 (ограничен насыщением флуоресценции)Техническая воспроизводимость> 99 %> 99 % Превалирующие современные методы — микрочипы и РНК-Seq — появились в середине 1990-х и 2000-х соответственно. Публикации по микрочипам, которые измеряли относительное содержание определённых транскриптов за счёт их гибридизации с комплементарными пробами, нанесёнными на микрочип, появились в 1995 году. Метод микрочипов позволял одновременно исследовать тысячи транскриптов, и за счёт этого позволял снизить стоимость исследования транскриптома в расчёте на ген и сэкономить усилия. До конца 2000-х лучшими методами транскрипционного профилинга были пятновые олигонуклеотидные чипы () и микрочипы с высокой плотностью. В течение этого периода было создано множество чипов, покрывающих известные гены модельных и экономически важных организмов. Улучшения технологий создания микрочипов привели к увеличению специфичности проб и количества генов, которые можно проанализировать с помощью одного чипа. Благодаря новым методам детекции флуоресценции стало возможным точно определять наличие и количество даже транскриптов, синтезируемых на низком уровне.

РНК-Seq подразумевает секвенирование кДНК, соответствующей транскриптам, причём численность отдельных фрагментов кДНК определяется численностью соответствующих транскриптов. Огромное влияние на РНК-Seq оказало развитие методов секвенирования нового поколения. Первым транскриптомным методом стало (), в основе которого лежало образование коротких последовательностей длиной от 16 до 20 пар оснований (п. о.) в ходе сложной последовательности гибридизаций. В 2004 году с помощью этого метода была оценена экспрессия 10 тысяч генов растения Arabidopsis thaliana. Первая работа, посвящённая РНК-Seq, была опубликована в 2006 году. В ходе этого исследования с помощью технологии была определена последовательность ста тысяч транскриптов. Полученного покрытия было достаточно для оценки относительного количества отдельных транскриптов. Популярность РНК-Seq значительно повысилась после 2008 года, когда технологии Illumina/Solexa позволили секвенировать один миллиард транскриптов. Благодаря этим данным сейчас возможно количественно оценивать и сравнивать транскриптомы разных людей.

Получение данных Получение данных о транскриптах возможно двумя принципиально различающимися путями: секвенированием отдельных транскриптов (EST или РНК-Seq) или гибридизацией транскриптов на упорядоченный чип нуклеотидных последовательностей (микрочип).

Выделение РНК Для всех транскриптомных методов необходимо выделить РНК из исследуемого организма. Несмотря на огромное разнообразие биологических систем, методика выделения РНК во всех случаях примерно одна и та же. Она включает разрушение клеток и тканей, разрушение РНКаз при помощи солей, разрушение макромолекул и комплексов, содержащих нуклеотиды, отделение РНК от ненужных биомолекул, включая ДНК, концентрирование РНК при помощи преципитации этанолом из раствора и очищение с помощью специальных . Выделенную РНК также можно дополнительно обработать ДНКазой, чтобы разрушить остатки ДНК. Обычно необходимо концентрирование мРНК, поскольку 98 % выделенной РНК приходится на рРНК. Концентрирование можно произвести с помощью методов, использующих наличие у мРНК поли(А)-хвоста, или путём удаления рРНК с помощью специфических проб. На результаты эксперимента может повлиять разрушенная РНК. Например, если отбирать мРНК из повреждённых РНК, то отобранные молекулы могут быть лишены 5'-концов и привести к искажению данных. Чтобы избежать разрушения РНК, перед её выделением образец обычно подвергают .

Экспрессируемые метки последовательностей Экспрессируемые метки последовательностей (EST) — это короткие нуклеотидные последовательности, полученные из целого транскрипта. Поскольку EST можно получить без какой-либо специфики относительно организма, из которого выделена РНК, их можно получить из смеси организмов или образцов, взятых из окружающей среды. Хотя в настоящее время чаще всего используется высокопроизводительное секвенирование, EST активно использовали при разработке первых микрочипов. Например, микрочип ячменя был получен из 350 тысяч предварительно секвенированных EST.

Сериальный и кэповый анализ экспрессии генов (SAGE/CAGE)

Сериальный анализ экспрессии генов является дальнейшим развитием технологии EST с большей выработкой меток. Он также позволяет провести некоторый количественный анализ численности транскриптов. РНК сначала переводится в кДНК, затем она разрезается на метки длиной 11 нуклеотидов с помощью рестриктаз, которые вносят разрывы в определённые последовательности ДНК. Полученные метки сшивают по типу «голова к хвосту» в длинные фрагменты длиной более 500 нуклеотидов, которые секвенируют с помощью низкопроизводительных, но дающих длинные методов, таких как секвенирование по Сэнгеру. Далее последовательности снова делят на 11-нуклеотидные кусочки с помощью специальных компьютерных программ (деконволюция). Если референсный геном недоступен, то полученные метки можно непосредственно использовать в качестве диагностических маркеров, которые в случае болезни экспрессируются иначе, чем в здоровом организме.

Кэповый анализ экспрессии генов () представляет собой вариант SAGE, при котором в качестве меток берутся только 5'-концевые последовательности мРНК. Поэтому, когда метки выравниваются на референсный геном, можно идентифицировать точки начала транскрипции генов. Этот метод активно используется для анализа промоторов и для клонирования полноразмерных кДНК.

SAGE и CAGE дают информацию о большем количестве генов, чем секвенирование отдельных EST, однако пробоподготовка и анализ данных в этих методах существенно сложнее.

Микрочипы

Принципы и преимущества Микрочип состоит из коротких олигонуклеотидов (проб), которые прикреплены в ячейках сетки на стеклянной подложке. Многочисленность транскриптов определяется на основании гибридизации транскриптов с этими пробами. в каждой ячейке свидетельствует о численности транскрипта, гибридизующегося с данной пробой.

Для создания микрочипа необходимо знать, хотя бы частично, геном исследуемого организма, например, в виде аннотированной последовательности или библиотеки EST; это необходимо для создания проб.

Методы