Вирус Сендай, или вирус парагриппа мышей, или вирус парагриппа 1 (, ранее ), — вид вирусов из семейства парамиксовирусов. Вирус является цитоплазматическим. Его геном, который представлен однонитевой нефрагментированной (-)РНК длиной нуклеотидов, реплицируется в цитоплазме. Вирионы имеют сферическую форму размером 150—250 нм. Вирус Сендай вызывает легко передающуюся инфекцию дыхательных путей у мышей, хомяков, морских свинок и крыс. Случаи инфекционных заболеваний, вызванные этим вирусом у человека, кошек, собак или сельскохозяйственных животных, не зарегистрированы. Вирус Сендай широко распространен в природе и встречается в мышиных колониях по всему миру .
Структура вириона Вирус Сендай является оболочечным вирусом: внешний слой представлен липидной оболочкой, в которой находятся: гликопротеин Гемагглютинин-Нейроминидаза (HN) с двумя ферментативными активностями (гемагглютинирующей и нейраминидазной), которые необходимы для адсорбции вируса на поверхности клетки-хозяина. Гликопротеин HN является мощным индуктором интерферона 1-го типа. В липидной оболочке вируса также находится белок слияния (F), который тоже является гликопротеином и обеспечивает проникновение вируса в клетки-хозяева после вирусной адсорбции. Белок F- производится в клетке в неактивной форме, однако, за счет протеаз, производимых клетками хозяевами, он расщепляется и превращается в биологически активную форму. Под липидной мембраной расположен матриксный белок (M), он формирует внутренний слой оболочки вируса. Вирус также содержит геномную РНК в комплексе с тремя белками, а именно Нуклеопротеином (NP), Фосфопротеином (P) и Полимеразой (L).
Структура генома Геном вируса Сендай представляет собой несегментированную РНК отрицательной полярности длиной 15384 нуклеотида и содержит некодирующие 3-штрих и 5-штрих области длиной около 50 нуклеотидов. Они являются цис-элементами, необходимыми для репликации (как и у других респировирусов из семейства Paramyxoviridae). Последовательность генов вируса Сендай выглядит следующим образом: три штрих-N-P-M-F-HN-L-пять штрих. Эти гены кодируют соответственно белок нуклеокапсида (N), малую субъединицу РНК-полимеразы или фосфопротеин (P), матриксный белок (M), белок слияния (F), гемагглютинин-нейраминидазу (HN) и большую субъединицу РНК-полимеразы (L). Дополнительные белки, которые часто называют неструктурными или вспомогательными белками, закодированы в альтернативных рамках считывания гена Р. Матричная РНК вируса Сендай P/C содержит пять участков инициации рибосом между позициями 81 и 201 с 5-штрих конца. Один из этих сайтов находится в открытой рамке считывания белка P, тогда как четыре других представляют собой вложенный набор белков C (C-штрих, C, Y1, Y2). Вирус Сендай использует рибосомное шунтирование для экспрессии белков Y1 и Y2, которые инициируются соответственно на четвёртом и пятом старт-кодонах P/C мРНК. В таких P/C мРНК также закодированы дополнительные белки. Два из них, V и W, являются продуктами редактирования мРНК в кодоне 317 (котранскрипционно добавляются соответственно один или два гуаниловых нуклеотида). Третий – Х-белок – представляет собой C-концевые 95 аминокислот белка Р. Его синтез инициируется рибосомами независимо. Все эти белки являются неструктурными и выполняют несколько функций, включая организацию синтеза вирусной РНК и помощь в избегании врождённого иммунитета хозяина. Также было обнаружено, что белок C способствует почкованию вирусных частиц, а небольшие количества белка C связаны с вирусным капсидом.
Клеточное сливание (образование синцития) Одной из интересных особенностей вируса Сендай является способность индуцировать образование синцитиев (многоядерных клеточных образований) в природных условиях и в клеточных культурах. Некоторые представители парамиксовирусов, включая вирус Сендай, выработали механизм распространения инфекции путем слияния инфицированных и неинфицированных клеток. При таком распространении инфекции вирус избегает нейтрализующих антител организма хозяина. Механизм этого процесса достаточно хорошо изучен, он похож на процесс слияния, используемый вирионом для проникновения в клетку. Функционирование двух вирусных гликопротеинов HN и F необходимо для обеспечения прохождения этого процесса. Свойство вируса Сендай сливать мембраны клеток с образованием синцития было использовано учеными для производства гибридом и моноклональных антител. Авторами изобретения являются Жорж Кёлер и Сесар Мильштейн. Они опубликовали соответствующую статью в 1975 году, а в 1984 году за свое изобретение они получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине. С тех пор были найдены более эффективные методы создания клеточных гибридов, однако первые гибридомы были получены с помощью вируса Сендай.
Применение
Использование в производстве лейкоцитарного интерферона Вирус Сендай обладает свойством индуцировать продукцию интерферона альфа в лейкоцитах животных и человека. Это свойство вируса используется для промышленного производства интерферона из лейкоцитов, полученных из донорской крови. Предложение о таком использовании вируса и экспериментальное доказательство такой возможности было сделано в научной работе Кари Кантелла опубликованной в 1981 году.Лейкоцитарный интерферон является лекарственным препаратом.
Потенциальное использование вируса как онколитического агента Одним из преимуществ вируса Сендай как потенциального онколитического агента является его безопасность. Несмотря на то, что вирус, в течение десятилетий, широко использовался в лабораторных исследованиях во всем мире, он никогда не провоцировал заболеваний у человека. Более того, вирус Сендай, в процессе клинических испытаний, после закапывания в нос взрослым и детям, не вызывал существенных побочных эффектов, но иммунизировал испытуемых к вирусу человеческого парагриппа 1-го типа. Это связано с тем, что вирус Сендай и вирус человеческого парагриппа 1 вызывают образование перекрестных антител. Ряд работ, проведенных в Японии, показал, что видоизмененный генно-инженерными методами, вирус Сендай может интенсивно распространяться в опухолевых клетках и уничтожать их, не затрагивая окружающие их нормальные клетки. Онколитическое действие вируса приводило к подавлению роста опухолей, состоящих из клеток человека у лабораторных животных. Новообразования на которые воздействовал вирус Сендай включают опухоли образованные клетками фибросаркомы, рака толстой кишки, поджелудочной железы и мозга. Также было показано, что рекомбинантный вирус Сендай с высокой эффективностью уничтожает опухоли меланомы, нейробластомы, плоскоклеточного рака, рака печени и простаты. Кроме того, после инактивации ультрафиолетом, при внутриопухолевом введении, вирус Сендай часто оказывал иммуностимулирующее действие. Это действие помогало вирусу подавлять рост опухолей у модельных животных, включая, рак толстой кишки, мочевого пузыря, почки и простаты. Описаны полные и частичные ремиссии опухолей тучных клеток (мастоцитом) у собак вызванные исключительно введением немодифицированного вируса Сендай. Кратковременная ремиссия после внутривенной инъекции живого вируса Сендай была описана у пациента с острой лейкемией в США в 1964 году. Подробно механизмы противоракового действия вируса Сендай описаны в обзорной работе под названием "Механизмы онколитического действия парамиксовируса Сендай".
Применение вируса Сендай в качестве вектора Вирус Сендай известен научному сообществу более 60 лет. Почти все это время он активно использовался как модельный патоген в молекулярно-биологических исследованиях. За последние три десятилетия интерес ученых был сфокусирован на этом вирусе как векторе для создания разнообразного набора генно-инженерных конструктов, включая конструкты для доставки трансгенов в клетку. За счет того, что репликация вируса происходит исключительно в цитоплазме, риск генетической интеграции вирусного генома в геном хозяина отсутствует, такая интеграция является проблемой для многих других вирусных векторов.
Добавление, удаление и модификация генов Рекомбинантные варианты вируса Сендай были созданы путем удаления некоторых вирусных генов таких как белок сливания, матриксный белок и белок геммагглютинин-нейраминидазы так и путем введения в вирусный геном новых генов. Вирусные конструкты так же создавались и путем модифиции в геноме вируса коротких участков ДНК. Например, был модифицирован фрагмент ДНК, кодирующий вирусный белок сливания (F). Белок сливания представляет собой мембранный гликопротеин типа I, который синтезируется в качестве неактивного предшественника (F0). Этот предшественник должен активироваться протеолитическим расщеплением по остатку аргинина-116. После расщепления предшественник F0 дает две дисульфид-связанные субъединицы F1 и F2. В некоторых генно-инженерных экспериментах сайт протеолитического расщепления F0 изменяли, что приводило к тому, что изменялся набор протеаз-клетки хозяина которые были способны разрезать и активировать F0. В результате, менялась тропность вируса. Он мог размножаться только в тех клетках, которые экспрессировали соответствующие протеазы.
Визуализация вирусной инфекции в клетке и в организме Для того чтобы наблюдать за инфекцией и распространением вируса Сендай прямо, непосредственно у живого животного был создан набор различных рекомбинантных конструктов. Они позволяют изучать как динамику распространения вируса, так и его исчезновения в процессе выздоровления животного. Некоторые конструкты были созданы для экспрессии зелёного флуоресцентного белка (GFP). Один из них, rSeV-GFP4, доступен коммерчески и имеется в продаже. Некоторые другие конструкты были созданы для экспрессии красного флуоресцентного белка RFP. Кроме того, были созданы конструкты для экспрессии гена люциферазы.
Перепрограммирование в индуцированные стволовые клетки (иСК) Одним из вариантов применения векторных конструктов на основе вируса Сендай является перепрограммирование соматических клеток в иСК. Полученные перепрограммированные клетки в конечном счете не экспрессируют трансгены. Система для такого перепрограммирования доступна для приобретения от ThermoFisher Scientific как CTS CytoTune-iPS 2.1 Sendai Reprogramming Kit, каталожный номер: A34546 .
Применение вируса Сендай в качестве вектора для создания вакцины Вирус Сендай имеет несколько особенностей, которые необходимы для векторной системы, на основе которой может быть создана эффективная вакцина: вирус не интегрируется в геном хозяина, он не подвергается генетической рекомбинации и он реплицируется только в цитоплазме без промежуточных генетических продуктов в ядре клетки. Вирус Сендай, как и все другие представители семейства парамиксовирусов эволюционирует очень медленно и генетически стабилен. Геном вируса чрезвычайно похож на геном вируса парагриппа человека 1 (Human Para-influenza Virus −1 (HPIV-1)), и оба вируса имеют общие антигенные детерминанты. В качестве вакцины для иммунизации против HPIV-1 вирус Сендай дикого типа использовался в клинических испытаниях с участием как взрослых, так и детей. Вирус закапывали испытуемым в нос в дозах в диапазоне от 5 × 105 до 5 × 107 50 % инфекционной эмбриональной дозы. Такого рода вакцинация приводила к выработке нейтрализующих антител к вирусу парагриппа человека 1 и не вызывала каких-либо ощутимых побочных эффектов. На основании этих испытаний можно заключить, что вирус Сендай безопасен для людей.