B-Raf («Серин/треониновая протеинкиназа B-raf»; ; КФ:2.7.11.25), или c-RAF («прото-онкоген c-RAF»; ) — цитозольная серин/треониновая протеинкиназа семейства . Продукт протоонкогена B-Raf BRAF.
Киназа B-Raf участвует в формирование внутриклеточных сигналов, направленных на клеточный рост. В 2002 году мутация гена BRAF была ассоциирована с развитием рака у человека. Некоторые другие мутации этого гена могут вызывать врождённые нарушения.
Разработаны терапевтические агенты для лечения онкологических заболеваний, вызванных мутациями BRAF. По крайней мере два таких агента — вемурафениб и дабрафениб были одобрены FDA к применению для лечения поздних стадий меланомы. Вемурафениб стал первым одобренным лекарственным агентом, разработанным на основе фрагментного дизайна лекарственных веществ.
Функции
Белок B-Raf - член семейства сигнальных протеинкиназ Raf. Белок играет роль в регуляции MAPK/ERK сигнальных путей, которые влияют на клеточное деление, дифференцировку и секрецию.
Структура Белок B-Raf состоит из 766 аминокислот. Молекула содержит три домена, которые характерны для белков семейства киназ Raf: структурный регион 1 (CR1), содержащий Ras-ГТФ-связывающий саморегулирующий домен; структурный регион 2 (CR2), обогащённый серином шарнирный участок и структурный регион 3 (CR3), протеинкиназный каталитический участок, который способен фосфорилировать каноническую последовательность на белковом субстрате. В активной конформации B-Raf формирует димер за счёт водородных и электростатических связей в киназном домене.
Домен CR1 Домен CR1 аутоингибирует киназный домен CR3 белка и является, таким образом, скорее регулирующим, чем структурным доменом. Участок белка человека 155–227 является Ras-ГТФ-связывающий участком, который при связывании с Ras-ГТФ, который при связывании с CR1 высвобождает последний и снимает аутоингибирование киназы. Последовательность 234–280 содержит мотив цинковый палец, который связывается с форболовым эфиром или диацилглицерином и участвует в закреплении B-Raf на клеточной мембране после связывания с Ras.
CR2 Домен CR1 обеспечивает подвижное шарнирное соединение между доменами CR1 и CR3 и действует как шарнир.
CR3
Домен CR3 (участок 457–717) является ферментативным киназным доменом белка. Это исключительно консервативная структура, состоящая из двух долей, соединённых небольшим шарнирным участком. Меньшая N-концевая доля домена (участок 457–530) отвечает в первую очередь за связывание АТФ, а большая C-концевая доля (участок 535–717) связывает белковый субстрат. Активный центр фермента находится в углублении между долями и каталиатическая Аспарагиновая кислота D576 локализована на C-концевой доле и обращена внутрь междолевого углубления.
Участки домена CR3 P-Петля B-Raf (участок 464–471) стабилизирует непереносящиеся фосфатные группу АТФ во время связывания фермента с АТФ. В частности серин-467, фенинлаланин-468 и глицин-469 формируют водородные связи с β-фосфатом АТФ для заякоривания молекулы АТФ. Функциональные мотивы киназного домена B-Raf были определены с помощью анализа их гомологии с протеинкиназой A.
Нуклеотид-связывающий пакет (V471, C532, W531, T529, L514 и A481) - гидрофобный пакет внутри которого аденин АТФ заякорен за счёт ван-дер-ваальсовых связей после связывания АТФ.
Каталитический центр включает участок 574–581, который обеспечивает перенос γ-фосфата АТФ от B-Raf на его белковый субстрат. В частности D576 действует как акцептор протона при активации нуклеофильного кислорода в гидроксильной группе серина или треонина в молекуле субстрата, что обеспечивает реакцию переноса фосфата за счёт щелочного катализа.
Мотив DFG включает остатки D594, F595 и G596 и является критическим мотивом B-Raf для функционирования белка как в неактивном, так и в активном состоянии. В неактивной конформации белка F595 занимает нуклеотид-связывающий пакет и предотвращает вход АТФ в пакет, снижая вероятность катализа. В активной конформации D594 связывает двухвалентный катион марганца, что стабилизирует β- и γ-фосфатные группы АТФ и ориентируя γ-фосфат для переноса на субстрат.
Петля активации включает участок 596–600, который образует сильную гидрофобную связь с P-петлёй в неактивной конформации киназы, запирая киназу в неактивном состоянии до тех пор пока активационная петля не фосфорилирована, что дестабилизирует эти связи за счёт присутствия отрицательного заряда. Это запускает переход киназы в активное состояние. В частности, L597 и V600 активационной петли взаимодействуют с G466, F468 и V471 P-петли, что сохраняет киназный домен в неактивном состоянии до фосфорилирования киназного домена.
Энзимология
B-Raf является серино-треониновой протеинкиназой и катализирует реакцию фосфорилирования остатков серина и треонина в специфической последовательности на белках-мишенях, используя АТФ как источник фосфата, образуя на выходе реакции АДФ и фосфорилированный белок. Киназа является строго регулируемым ферментом, участвующим в переносе сигнала, поэтому для того, чтобы стать активным B-Raf должен связаться с ГТФ-Ras. После того как B-Raf активирован, консервативное каталитическое ядро киназы фосфорилирует белковые субстраты путём нуклеофильной атаки атома кислорода гидроксильной группы серина или треонина γ-фосфатной группой АТФ в ходе реакции бимолекулярного нуклеофильного замещения
Активация
Снятие CR1 аутоингибирования В нормальном неактивном состоянии киназный домен CR3 заблокирован за счёт двух механизмов: аутоингибирование собственным регуляторным доменом CR1 и отсутствием пост-трансляционного фосфорилирования ключевых серина и тирозина в шарнирном регионе CR2. Во время активации B-Raf аутоингибирующий домен CR1 связывает эффекторный домен ГТФ-Ras в своём Ras-связывающем участке и, в результате, высвобождает каталитический домен CR3. Взаимодействие CR1-Ras в дальнейшем усиливается за счёт связывания цистеин-обогащённого субдомена с Ras и фосфолипидами клеточной мембраны. В отличие от A-Raf и C-Raf, домен CR2 которых должен быть фосфорилирован по определённым гидроксильным группам определённых аминокислот, в B-Raf домен CR2 постоянно фосфорилирован по S445. Это позволяет отрицательно заряженному фосфосерину немедленно отдалить киназный домен CR1 за счёт стерических и электростатических взаимодействий как только регуляторный домен отсоединён, освобождая киназный домен для взаимодействия с белками-субстратами.
Активация CR3 После ухода аутоингибирующего регуляторного домена CR1 киназный домен CR3 должен перейти в АТФ-связанную активную конформацию. В неактивной конформации F595 в мотиве DFG блокирует гидрофобный аденин-связывающий карман, в то время как активирующая петля образует гидрофобное взаимодействие с P-петлёй, предотвращая связывание АТФ с АТФ-связывающим участком. После того, как активирующая петля фосфорилируется, отрицательный заряд фосфата дестабилизирует гидрофобное взаимодействие с P-петлёй. В результате активирующая петля меняет конформацию, вытягиваясь вдоль C-концевой доли киназного домена. В ход этого процесса она формирует взаимодействия стабилизирующего β-листа с β6-структурой. Одновременно фосфорилированный остаток подходит к лизину K507, формируя стабилизирующий солевой мостик и запирает активирующую петлю в этом положении. Мотив DFG меняет конформацию с активирующей петлёй, вызывая выход остатка F595 из аденин-связывающего участка в гидрофобный карман, расположенный рядом с альфа-спиралью. В результате этих перемещений мотива DFG и активирующей петли фосфорилирование открывает АТФ-связывающий участок. Поскольку субстрат-связывающий и каталитический участки уже находились на своём месте, фосфорилирование активирующей петли само по себе активирует киназный домен B-Raf за счёт описанной цепной реакции, которая фактически открывает крышку готового активного центра.
Каталитический механизм
Для эффективного катализа фосфорилирования белка через бимолекулярный обмен остатков серина и треонина с АДФ в качестве уходящего продукта реакции B-Raf должен сначала связать АТФ, а затем стабилизировать промежуточное состояние в то время как γ-фосфат АТФ переносится.
Связывание АТФ B-Raf связывает АТФ за счёт заякоривания аденинового нуклеотида в неполярном кармане и ориентирует АТФ за счёт водородных связей и электростатических взаимодействий с фосфатными группами. В дополнение к P-петле и мотива DFG в стабилизировании непереносящихся фосфатных групп участвуют также остатки K483 and E501. Положительный заряд первичной амино-группы остатка K483 позволяет стабилизировать отрицательный заряд на α- and β-фосфатных группах АТФ, когда АТФ связывается с киназой. В отсутствии АТФ положительный заряд нейтрализуется отрицательным зарядом карбоксильной группы E501.
Фосфорилирование Когда АТФ связана с киназным доменом B-Raf, D576 каталитического центра фермента активирует гидроксильную группу белка-субстрата, увеличивая её нуклеофильность для запуска реакции фосфорилирования, тогда как прочие аминокислотные остатки каталитического центра стабилизируют промежуточное состояние. N581 хелатирует двухвалентный катион магния, связанного с АТФ, помогая правильной ориентировке молекулы для оптимальной реакции замены. K578 нейтрализует отрицательный заряд на γ-фосфате АТФ таким образом, что активированный субстрат не подвергается электронному отталкиванию в процессе реакции с фосфатом. После переноса фосфатной группы полученные продукты реакции АДФ и фосфопротеин высвобождаются из каталитического центра фермента.
Ингибиторы Поскольку мутантные формы постоянно активной киназы B-Raf приводят к развитию раковых опухолей из-за повышенного клеточного сигнала, направленного на рост клеток, ингибиторы как неактивной, так и активной конформаций киназного домена белка были разработаны как противоопухолевые препараты.
Сорафениб
BAY43-9006 (Сорафениб, в составе препарата Nexavar, Bayer AG) является ингибитором мутантной формы B-Raf V600E, одобренным FDA для лечения первичных злокачественных опухолей печени и почек. Ингибитор блокирует киназный домен B-Raf, запирая фермент в его неактивной форме. Ингибитор достигает этого, блокируя АТФ-связывающий карман за счёт высокой аффинности к киназному домену. Затем он связывается с активирующей петлёй и мотива DFG, останавливая переход этих участков в активное состояние. Наконец, трифторометилфенильная составляющая ингибитора стерически блокирует активирующую петлю и мотив DFG и делает невозможным их трансформацию в активную конформацию.
Дистальная пиридиновая группа ингибитора заякоривается в гидрофобном нуклеотид-связывающем кармане N-доли киназного домена, взаимодействуя с белковыми остатками триптофана W531 и фенилаланинов F583 и F595. Гидрофобные связи ингибитора с F583 каталитического центра фермента и F595 мотива DFG стабилизирует неактивную конформацию этих участков, снижая вероятность активации фермента. Последующие гидрофобные взаимодействия центрального фенильного кольца ингибитора с остатками K483, L514 и T529 фермента ещё более увеличивают аффинность ингибитора к киназному домену фермента. Гидрофобное взаимодействие остатка F595 с ингибитором также энергетически ещё больше снижает вероятность конформационного перехода DFG. Наконец, полярные взаимодействия ингибитора с киназным доменом далее повышают аффинность связывания ингибитора с ферментом и ещё более стабилизируют мотив DFG в его неактивном состоянии. Остатки E501 и C532 связываются водородными связями с остатком мочевины и пиридина в молекуле ингибитора, соответственно. Карбонильная группа остатка мочевины в молекуле ингибитора связывается водородной связью с азотом амида в остатке D594, что в результате полностью запирает мотив DFG.
Трифторометилфенильная группа цементирует термодинамическое предпочтение неактивной конформации при связывании киназного домена с ингибитором за счёт стерической блокировки гидрофобного кармана между αC- и αE-спиралей мотива DFG и активирующей петлёй, который должен бы быть задействован при переходе фермента в активную конформацию.
Вемурафениб