Каталитическая триада — это набор из трех скоординированных аминокислот, которые можно найти в активном центре некоторых ферментов. Каталитические триады чаще всего встречаются в ферментах гидролаз и трансфераз (например, протеазы, амидазы, эстеразы, ацилазы, липазы и β-лактамазы). Триада кислота-основание-нуклеофил является распространенным мотивом для образования нуклеофильного остатка для ковалентного катализа. Остатки образуют сеть реле заряда для поляризации и активации нуклеофила, который атакует субстрат, образуя ковалентный промежуточный продукт, который затем гидролизуется с высвобождением продукта и регенерацией свободного фермента. Нуклеофилом чаще всего является аминокислота серин или цистеин, но иногда треонин или даже селеноцистеин. Трехмерная структура фермента объединяет триадные остатки в точной ориентации, даже если они могут находиться далеко друг от друга в последовательности (первичная структура).

Помимо дивергентной эволюции функции (и даже нуклеофила триады), каталитические триады демонстрируют одни из лучших примеров конвергентной эволюции. Химические ограничения катализа привели к тому, что одно и то же строение каталитических центров развилось независимо по крайней мере в 23 отдельных суперсемействах. Вследствие этого, их механизм действия является одним из наиболее изученных в биохимии.

История Ферменты трипсин и химотрипсин были впервые очищены в 1930-х годах. Для них серин был идентифицирован как каталитический нуклеофил (путем модификации диизопропилфторфосфата) в 1950-х годах. Структура химотрипсина была изучена с помощью рентгеновской кристаллографии в 1960-х годах, что показало ориентацию каталитической триады в активном центре. Другие протеазы, которые были секвенированы и выровнены, чтобы выявить семейство родственных протеаз, теперь называется семейством S1. Одновременно в структурах эволюционно не связанных протеаз папаина и субтилизина были обнаружены аналогичные триады. В конце 1960-х годов был предложен механизм «реле заряда», который подразумевает активацию нуклеофила другими членами триады. Поскольку в 1970-х и 80-х годах с помощью рентгеновской кристаллографии было изучено все больше протеазных структур, были обнаружены гомологичные (например, протеаза TEV) и аналогичные (например, папаин) триады. Система классификации MEROPS в 1990-х и 2000-х годах начала классифицировать протеазы по структурно связанным суперсемействам ферментов и, таким образом, действует как база данных конвергентной эволюции триад в более чем 20 суперсемействах. Понимание того, как химические ограничения эволюции привели к конвергенции стольких семейств ферментов с одной и той же геометрией триад, появилось в 2010-х годах.

С момента первоначального открытия каталитических триад, их точный каталитический механизм подвергался все более и более детальным исследованиям. В 1990-х и 2000-х годах особое внимание уделялось вопросу о том, способствуют ли водородные связи с низким барьером катализу, или достаточно обычной водородной связи, чтобы объяснить механизм. Огромный объём работ по ковалентному катализу с реле заряда, используемому каталитическими триадами, привел к тому, что этот механизм лучше всего охарактеризован во всей биохимии.

Функция Ферменты, содержащие каталитическую триаду, используют её для одного из двух типов реакций: либо для расщепления субстрата (гидролазы), либо для переноса одной части субстрата на второй субстрат (трансферазы). Триады представляют собой взаимозависимый набор остатков в активном центре фермента и действуют совместно с другими остатками (например, сайт связывания и оксианионное отверстие) для достижения нуклеофильного катализа. Эти остатки триады действуют вместе, чтобы сделать нуклеофильный элемент высокореактивным, образуя ковалентный промежуточный продукт с субстратом, который затем растворяется для завершения катализа.

Механизм Каталитические триады выполняют ковалентный катализ, используя остаток в качестве нуклеофила. Реакционная способность нуклеофильного остатка увеличивается за счет функциональных групп других членов триады. Нуклеофил поляризован и ориентирован основанием, которое само связывается и стабилизируется кислотой.

Катализ проводится в два этапа. Во-первых, активированный нуклеофил атакует карбонильный углерод и заставляет карбонильный кислород принять электронную пару, что приводит к тетраэдрическому промежуточному соединению. Наращивание отрицательного заряда на этом промежуточном продукте обычно стабилизируется оксианионной дырой в активном центре. Промежуточный продукт затем коллапсирует обратно до карбонила, выбрасывая первую половину субстрата, но оставляя вторую половину все ещё ковалентно связанной с ферментом в качестве промежуточного ацил-фермента. Хотя общий кислотный катализ разрушения первого и второго тетраэдрических интермедиатов может происходить по пути, показанному на диаграмме, доказательства, подтверждающие этот механизм с химотрипсином, были оспорены.

Вторая стадия катализа — это разделение промежуточного ацил-фермента путем атаки на второй субстрат. Если этот субстрат — вода, то результатом будет гидролиз; если это органическая молекула, то результатом является перенос этой молекулы на первый субстрат. Атака на второй субстрат формирует новый тетраэдрический промежуточный продукт, который распадается путем выброса нуклеофила фермента, высвобождения второго продукта и регенерации свободного фермента.

Идентичность членов триады

Нуклеофил Боковая цепь нуклеофильного остатка выполняет ковалентный катализ на субстрате. Неподеленная пара электронов, присутствующая на кислороде или сере, атакует электроположительный карбонильный углерод. 20 природных биологических аминокислот не содержат достаточно нуклеофильных функциональных групп для многих сложных каталитических реакций . Включение нуклеофила в триаду увеличивает его реакционную способность для эффективного катализа. Наиболее часто используемые нуклеофилы — это гидроксил (ОН) серина и тиол / тиолат-ион (SH / S-) цистеина. Альтернативно, треониновые протеазы используют вторичный гидроксил треонина, однако из-за стерической помехи дополнительной метильной группы боковой цепи такие протеазы используют свой N -концевой амид в качестве основания, а не отдельную аминокислоту.

Использование кислорода или серы в качестве нуклеофильного атома вызывает незначительные различия в катализе. По сравнению с кислородом дополнительная d-орбиталь серы делает её больше (на 0,4 Å) и мягче, позволяет ей образовывать более длинные связи (dC-X и dX-H больше в 1,3 раза) и дает более низкое значение pKa (на 5 единиц). Следовательно, серин в большей степени, чем цистеин, зависит от оптимальной ориентации членов кислотно-основной триады для снижения его pKa для достижения согласованного депротонирования с катализом. Низкий pKa цистеина работает для него невыгодно при разделении первого тетраэдрического промежуточного соединения, поскольку непродуктивное обращение исходной нуклеофильной атаки является более благоприятным продуктом распада. Таким образом, основание триады предпочтительно ориентировано на протонирование амида уходящей группы, чтобы гарантировать, что он выбрасывается, оставляя серу фермента ковалентно связанной с N-концом субстрата. Наконец, разделение ацил-фермента (для высвобождения С-конца субстрата) требует повторного протонирования серина, тогда как цистеин может уйти в виде S-. С точки зрения стерического эффекта сера цистеина также образует более длинные связи и имеет более объемный радиус Ван-дер-Ваальса и при мутации в серин может быть захвачен в непродуктивных ориентациях в активном центре.

Очень редко атом селена аминокислоты селеноцистеина используется в качестве нуклеофила. Депротонированное состояние Se- сильно предпочтительнее в каталитической триаде.

Основание Поскольку никакие природные аминокислоты не являются сильно нуклеофильными, основание в каталитической триаде поляризует и депротонирует нуклеофил для увеличения его реакционной способности. Кроме того, он протонирует первый продукт, чтобы способствовать его уходу из группы.

Основанием чаще всего является гистидин, поскольку его pKa позволяет осуществлять эффективный щелочной катализ, водородную связь с кислотным остатком и депротонирование нуклеофильного остатка. β-лактамазы, такие как ТЕМ-1, используют остаток лизина в качестве основания. Поскольку pKa лизина очень велико (pKa = 11), глутамат и несколько других остатков действуют как кислота, стабилизируя его депротонированное состояние во время каталитического цикла. Треониновые протеазы используют свой N-концевой амид в качестве основания, поскольку стерическое вытеснение метила каталитического треонина препятствует тому, чтобы другие остатки находились достаточно близко друг к другу.

Кислота Кислотный член триады образует водородную связь с основным остатком. Это выравнивает основный остаток, ограничивая вращение его боковой цепи, и поляризует его, стабилизируя его положительный заряд. Две аминокислоты имеют кислые боковые цепи при физиологическом pH (аспартат или глутамат) и поэтому наиболее часто используются для этого члена триады. Цитомегаловирусная протеаза использует пару гистидинов, один как обычно, а другой как кислоту. Второй гистидин не является такой эффективной кислотой, как более распространенный аспартат или глутамат, что приводит к более низкой каталитической эффективности. В некоторых ферментах кислотный член триады менее необходим, а некоторые действуют только как диада. Например, папаин использует аспарагин в качестве своего третьего члена триады, который ориентирует гистидиновое основание, но не действует как кислота. Точно так же протеаза вируса гепатита A содержит упорядоченную воду в том месте, где должен находиться кислотный остаток.

Примеры триад

Сер-Гис-Асп Мотив серин-гистидин-аспартат является одним из наиболее подробно описанных каталитических мотивов в биохимии. Примером этой триады является химотрипсин, модельная сериновая протеаза из суперсемейства PA, которая использует свою триаду для гидролиза белковых скелетов. Аспартат связан водородными связями с гистидином, увеличивая pKa его имидазольного азота с 7 до примерно 12. Это позволяет гистидину действовать как мощная общая основа и активировать сериновый нуклеофил. Он также имеет оксианионное отверстие, состоящее из нескольких амидов основной цепи, которое стабилизирует накопление заряда на промежуточных соединениях. Основание гистидина помогает первой уходящей группе, отдавая протон, а также активирует гидролитический водный субстрат, отводя протон, поскольку оставшийся ОН- атакует промежуточный ацил-фермент.

Та же самая триада также конвергентно эволюционировала в α / β гидролазах, таких как некоторые липазы и эстеразы, однако ориентация членов триады обратная. Кроме того, было обнаружено, что ацетилгидролаза головного мозга (которая имеет ту же форму, что и небольшой G-белок) также имеет эту триаду. Эквивалентная триада Сер-Гис-Глу используется в ацетилхолинэстеразе.

Цис-Гис-Асп Вторая наиболее изученная триада — это мотив цистеин-гистидин-аспартат. Этот набор триад используют несколько семейств цистеиновых протеаз и папаин. Триада действует аналогично триадам сериновых протеаз с некоторыми заметными отличиями. Из-за низкого pKa цистеина важность Асп для катализа варьируется, и некоторые цистеиновые протеазы эффективно являются Цис-Гис-диадами (например, протеазой вируса гепатита A), тогда как в других цистеин депротонируется ещё до начала катализа (например, папаин). Эта триада также используется некоторыми амидазами, такими как N-гликаназа, для гидролиза непептидных связей CN.

Сер-Гис-Гис Триада цитомегаловирусной протеазы использует гистидин в качестве членов как кислотной, так и основной триады. Удаление кислотного гистидина приводит только к 10-кратной потере активности (по сравнению с более чем 10 000-кратной, когда аспартат удаляется из химотрипсина). Эта триада была интерпретирована как возможный способ создания менее активного фермента для контроля скорости расщепления.

Сер-Глу-Асп