SEREX-метод (серологический анализ рекомбинантных экспрессионных (опухолевых) библиотек кДНК) — устаревшая методика анализа библиотек опухолевых антигенов с помощью индивидуального иммунного IgG-ответа. Это фундаментальный метод онкоиммунологии, послуживший продолжением аутологичному типированию, с помощью которого были открыты одни из важнейших антигенов для таргетной терапии рака (NY-ESO-1, MAGE, SSX2, SCP-1, мутантный p53 и т.д.).

Принцип SEREX-исследования

Создание кДНК библиотеки Классическое SEREX-исследование подразумевает использование E. coli в качестве агента экспрессии раково-тестикулярных антигенов. Для формирования у E. coli инструкций экспрессии, на изолированной матрице мРНК, с помощью обратной транскриптазы, создается цепочка кДНК, в которой содержится информация для синтеза целевых антигенов. Полученную кДНК клонируют в вектор экспрессии λ-фага, который затем трансдуцируют в E. coli. Трансдуцированные E. coli синтезируют целевые белки и лизируются, а полученные из лизисных бляшек антигены переносятся на нитроцеллюлозную подложку (блоттинг).

Иммуноскрининг Антигены помещают в сыворотку крови пациента, которая в процессе адсорбции предварительно обедняется лизатами на нецелевые иммуноглобулины E. coli и их фагов. Далее сыворотку инкубируют вместе с целевыми белками, где аутоантитела из сыворотки связываются с антигенами. Подложку промывают и вводят конъюгированные вторичные антитела, которые связываются с IgG целевыми антителами. Из подсвеченных вторичными антителами участков (бляшек) забирают (позитивный клон), из которых выделяют кДНК вставку и анализируют ее последовательности сопоставляя с известными антигенами найденными в GenBank или определяя антиген как новый опухолевый маркер. Расширенный комплекс критериев для выборки антигена C помощью SEREX определяемые антигены предварительно оценивают, прежде чем они станут новыми целевыми антигенами для активной иммунотерапии, по нескольким критериям. Например, явный гуморальный ответ можно ожидать от раково-тестикулярных антигенов, которые в норме экспрессируются в недоступных для IgG антител тканях. Например, антигены (NY-ESO-1, MAGE, GAGE, BAGE, HOM-MEL-40 (SSX2), P815 и др.) в норме содержаться только за гематотестикулярным барьером, но могут обнаруживаться в большом количестве в таких опухолях как, например меланома. Это дает яркий иммунный ответ от CD8+ и CD4+ и позволяет использовать антиген в качестве мишени для создания противоопухолевых вакцин и CAR-T/TCR-T клеточной терапии. Активный IgG ответ также можно ожидать и от повышения интенсивности экспрессии антигенов, которые не изолированы от Т-киллеров и Т-хелперов. Так, например, выявляется антиген дифференцировки рака молочной железы NY-BR-1.

Общие критерии Стабильность экспрессии Высокая гетерогенность опухолевых клеток часто приводит к утрате экспрессии отдельных антигенов, что заставляет специалистов выделять консервативные белки, которые не перестанут определяться при метастазировании, например раково-тестикулярные антигены MAGE, NY-ESO-1. Такие белки не элиминируют и хорошо определяются на всех стадиях развития опухоли. Значимость драйверной мутации Для мишени важно выбирать уникальные для онкогенных клеток антигены, которые непосредственно влияют на жизнедеятельность или способность к делению опухолевой клетки. Если без антигена клетка погибает (апоптоз), то он является устойчивым маркером для дальнейшего таргетирования. Это гарантирует наличие мишени в следующих поколениях опухоли и метастазах, а также позволяет напрямую ингибировать антиген, вызывая апоптоз. Степень и частота экспрессии в популяции Это статистический фильтр, который указывает на частоту обнаружения отдельного антигена у людей с опухолью. Генез опухоли часто может отличаться, некоторые специфичные антигены характерны для разных типов рака, например NY-ESO-1 обнаруженный благодаря SEREX-исследованию путем выделения антигена из опухоли пищевода встречается и в других видах рака (меланоме, раке легкого, раке мочевого пузыря, синовиальной саркоме и раке яичников). Степень интенсивности экспрессии Некоторые опухолеассоциированные антигены в норме присутствуют в здоровых клетках, но при развитии рака клетка может их экспрессировать в гораздо большем количестве, например белок BIRC5, тормозящий естественный апоптоз, помимо явного гуморального ответа IgG, также являясь значимым драйверным компонентом онкогенеза. Эти антигены являются важным критерием выборки, но для таргетного иммунного ответа их использовать нельзя, из-за их наличия в здоровых тканях.

Специфичные SEREX-критерии Посттрансляционные модификации (ПТМ) Поскольку библиотеки кДНК экспрессируются в прокариотических системах по типу E. coli, в классическом SEREX-исследовании есть серьезные ограничения в экспрессировании антигенов, в которых целевым маркером для иммунного ответа являются посттрансляционные цепи, например олигосахаридные и гликановые. Некоторые антигены вообще не могут сформироваться без ПТМ в прокариотичекских клетках или выпадают в виде тельца включения. Принцип МНС и локализация В зависимости от конечного местонахождения белка есть два способа вызвать иммунный ответ: Ядерные и цитоплазматические белки хорошо экспрессируются клетками E. coli и хорошо подходят для T-клеточного ответа, так как почти всегда выставляются на мембрану МНС класса I для дальнейшего обнаружения Т-лимфоцитами. Мембранные белки часто вызывают мгновенный гуморальный ответ и легко определяются даже без привлечения MHC класса I, но часто выпадают из SEREX-скрининга из-за практической невозможности синтезировать их на кДНК матрице через E. coli систему.

Модифицированный эукариотический SEREX-метод Когда антигену требуются посттрансляционные модификации (ПТМ) создается эукариотическая библиотека экспрессии, где полученные кДНК клонируют в плазмидные или вирусные векторы экспрессии. В этом методе плазмидами или вирусами трансфецируются эукариотические клетки, например дрожжи.

Фундаментальная проблема системы E. coli заключается в том, что она не может обеспечить полноценное формирование библиотек опирающихся на специфику фолдинга, гликозирования или других посттрансляционных модификаций, которые в норме присутствуют в белках эукариотических организмов, так как иммунная система часто вырабатывает антитела именно на их нативные конформационные эпитопы. Некоторые специфичные углеводные цепочки сами по себе являются опухоле-ассоциированными, так как нормальный профиль присоединения сахара у них может быть нарушен (аберрантное гликозирование). Например, экспрессируемый этим методом, мембранный гликопротеин MUC1 в норме почти на 80 % по массе состоит из углеводов.

Эукариотические клетки (дрожжи, клетки насекомых или линии клеток млекопитающих) могут обеспечить сложный процессинг сборки белков учитывая все конформационные модификации. Для этого вместо фаговых векторов создаются характерные для эукариот плазмидные векторы.

История В основу SEREX лег метод аутологичного типирования разработанный в 1970-х годах для анализа гуморального ответа на собственные раковые клетки пациентов. В 1976 году Т.Э.Кэрри, Т.Такахаши, Л.А.Резник опубликовали статью в журнале PNAS, в которой описали активацию антител в сыворотке крови пациента на клетки линии меланомы. В этом же году Хироши Шику с командой опубликовали вторую статью, где с помощью серологического типирования с использованием иммуноадгезионных анализов описали два новых поверхностных антигена. Позднее, в 1978 году М.Пфройндшу провел аналогичные исследования для опухоли головного мозга и определил ещё три класса клеточных поверхностных антигенов астроцитомы.

Основным ограничением для аутологического типирования была необходимость поддерживать долгоживущие клеточные линии и только: меланома, рак почек и злокачественные опухоли головного мозга in vitro, давали жизнеспособные клеточные линии и имели перспективу для типирования. В середине 1990-х Михаэль Пфройндшу с командой взяли за основу исследование Кэрри, Такахаши и Олда и в 1995 году в Саарском университете доработали его, заменив живые клетки опухоли на бактериофаги, внутри которых были клонированы отдельные участки кДНК, а не антитела, что решило проблему ограниченности аутологичного типирования устойчивых клеточных линий.

Первоначальное название метода SEREX, как писал в своих мемуарах доктор Олд происходило от «serologia rex» (серология как король в иммунологии опухолей). А официальное название (серологическая идентификация антигенов методом рекомбинантного экспрессионного клонирования) было придумано позже, когда речь зашла о публикации в научных журналах. Изначально к этой методике относились со скептицизмом, но благодаря тому, что куратор исследования — доктор Олд, был членом Национальной Академии наук, первую рукопись упоминаемую как «SEREX-метод» опубликовали уже в 1995 году в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences.

Примечания

Категория:Молекулярная биология Категория:Белки Категория:Онкоиммунология Категория:Онкогены Категория:Онкогенез