CRISPR (от — короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) — особые локусы бактерий и архей, состоящие из прямых повторяющихся последовательностей, которые разделены уникальными последовательностями (спейсерами). Спейсеры заимствуются из чужеродных генетических элементов, с которыми сталкивалась клетка (бактериофагов, плазмид). РНК, транскрибирующиеся с локусов CRISPR, совместно с ассоциированными белками Cas обеспечивают адаптивный иммунитет за счёт комплементарного связывания РНК с нуклеиновыми кислотами чужеродных элементов и последующего разрушения их белками Cas. Впрочем, к настоящему моменту имеется немало свидетельств участия CRISPR в процессах, не связанных с иммунитетом.
Использование для направленного редактирования геномов является перспективным направлением в современной генной инженерии. учёные широко используют подходы, основанные на системах CRISPR-Cas. А начиная с 2023 года эти подходы начали применяться в медицине для лечения наследственных заболеваний.
Также CRISPR-Cas имеет значение для адресной доставки лекарств и их высвобождения при внешнем воздействии — для этого используются материалы, в состав которых входят участки ДНК.
История изучения Первый локус CRISPR был обнаружен у бактерии Escherichia coli в 1987 году группой японских учёных во главе с . Они заметили в геноме этой бактерии повторяющиеся элементы, разделённые неповторяющимися последовательностями (спейсерами); впрочем, учёные не придали своему наблюдению большого значения. Масштабное изучение CRISPR начал испанский исследователь Франсиско Мохика, в 1993 году обнаруживший повторяющиеся последовательности, разделённые промежутками, в геноме археи Haloferax mediterranei. Он обратил внимание, что повторы в геномах этой археи и E. coli очень похожи по структуре, однако не имеют ничего общего в последовательностях нуклеотидов. По предположению Мохика, столь похожие по структуре повторы, имеющиеся у систематически весьма далёких групп прокариот, должны выполнять какую-то очень важную функцию. Первоначально он назвал новый класс повторов «короткими повторами, регулярно разделёнными промежутками» (), однако впоследствии, по его предложению, это название было заменено на «короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами» (). Мохика продолжил поиски CRISPR в геномах других микробов, и к 2000 году он обнаружил их у 20 микроорганизмов, в том числе чумной палочки Yersinia pestis и других патогенов. В 2002 году были открыты гены cas — гены локусов CRISPR, кодирующие белки Cas.
Несмотря на обнаружение систем CRISPR-Cas у самых разнообразных прокариот, о функциях CRISPR практически ничего не было известно вплоть до 2005 года. В 2005 году Мохика и его коллеги опубликовали результаты своих новых исследований, в которых было установлено, что спейсеры соответствуют последовательностям из геномов бактериофагов, а также участкам плазмид. Они также обнаружили, что штаммы E. coli, чьи локусы CRISPR содержат спейсер, соответствующий фагу Р1, устойчивы к этому фагу, и сделали вывод о связи локусов CRISPR с адаптивным иммунитетом прокариот. В том же году появились публикации ещё двух исследовательских групп, которые пришли к такому же заключению.
В 2006 году была разработана классификация известных CRISPR и предложен возможный механизм работы основанного на CRISPR адаптивного иммунитета. В 2007 году исследовательской группой во главе с было окончательно установлено и экспериментально доказано участие CRISPR в обеспечении работы специфичного к последовательностям-мишеням адаптивного иммунитета; одновременно была выявлена ключевая роль белков Cas в этом процессе. За это достижение в 2015 году он был удостоен премии Мэссри () вместе с другими учёными, внёсшими значительный вклад в изучение CRISPR (Дженнифер Даудна и Эмманюэль Шарпантье). В 2008 году было показано, что для работы системы CRISPR необходима особым образом процессированная CRISPR-РНК (crРНК), а также была продемонстрирована способность системы CRISPR осуществлять ДНК-интерференцию. Интерференция, направляющие РНК и нацеленность против специфических последовательностей ДНК — три открытия 2007—2008 годов, которые положили начало развитию основанных на CRISPR методов генетической инженерии.
Ряд последующих важных открытий, касающихся устройства систем CRISPR типа II (в частности, выяснение необходимости для её работы белка Cas9 и дополнительной — помимо crРНК — малой РНК, названной tracrРНК), позволил в 2012 году экспериментально опробовать первую искусственно разработанную систему CRISPR типа II. В начале 2013 года (с интервалом около двух недель друг от друга) несколько групп показали, что искусственные системы CRISPR-Cas могут работать не только в клетках бактерий и in vitro, но и в клетках эукариот. В 2012 года литовский биохимик Виргиниюс Шикшнис одним из первых продемонстрировал программируемое расщепление ДНК одним из компонентов CRISPR-Cas систем белком Cas9, начиная с 2007 года, основным направлением его исследований было изучение недавно открытых CRISPR-Cas систем защиты бактерий от бактериофагов и чужеродного генетического материала.Lander ES: The Heroes of CRISPR. Cell 2015, 164:18-28. doi:10.1016/j.cell.2015.12.041Gasiunas G, Barrangou R, Horvath P, Siksnys V: Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A 2012, 109:E2579-2586. doi: 10.1073/pnas.1208507109 По словам Шикшниса, его статья даже не была признана серьезной редакцией академического журнала и не была отправлена рецензентам, поэтому время, необходимое для признания её первой, было потерянно. Мартин Шлак сообщил, что Шикшнис представил свою статью, описывающую расщепление ДНК с помощью Cas9, в рецензируемом научном журнале 18 апреля 2012 года. После того, как она была отклонена без экспертной оценки, он месяц спустя отправил ее в рецензируемый научный журнал PNAS, и на рассмотрение и публикацию ушло несколько месяцев. Тем временем американский биохимик Дженнифер Даудна и французский микробиолог Эмманюэль Шарпантье опубликовали свою статью в рецензируемый научный журнал Science, где она была рассмотрена и принята в течение двух недель. Вскоре технология редактирования генома с помощью Cas9 была лицензирована фирмой DuPontGrushkin D: DuPont in CRISPR-Cas patent land grab. Nat Biotechnol 2016, 34:13-13. doi: 10.1038/nbt0116-13. За создание новых технологий, позволяющих проводить с помощью CRISPR-Cas9 редактирование генома Эмманюэль Шарпантье и Дженнифер Даудна получили Нобелевскую премию по химии 2020 года.
Последующие два с половиной года происходила разработка методов CRISPR и применение этого метода в различных группах организмов. В апреле 2015 года группа учёных из Китая опубликовала результаты своего исследования, в котором с помощью CRISPR-Cas9 были отредактированы геномы человеческих эмбрионов. Однако точность редактирования в этом эксперименте была очень низка, а сам эксперимент был неоднозначно воспринят научным сообществом. В начале 2016 года учёные из США сообщили, что смогли понизить количество ошибок при работе CRISPR-Cas9 почти до нуля. К настоящему моменту CRISPR считают наиболее важным технологическим новшеством в науках о жизни со времён изобретения полимеразной цепной реакции (ПЦР), открытой тремя десятилетиями ранее.
В 2016 году группа учёных выяснила, что системы CRISPR-Сas произошли от потерявших мобильность и закрепившихся в геноме транспозонов. Филогенетическое исследование показало, что все эндонуклеазы Cas произошли от единственного транспозона из всех несущих эндонуклеазу IscB транспозонов.
В 2023 году впервые была одобрена генная терапия с использованием CRISPR. Препарат под названием эксагамглоген аутотемцел (торговое название Casgevy), разработанный компаниями CRISPR Therapeutics и Vertex Pharmaceuticals, предназначен для лечения серповидноклеточной анемии и бета-талассемии у пациентов в возрасте 12 лет и старше.
Общие принципы
Системы CRISPR-Cas различаются как структурно, так и функционально. Тем не менее, всем системам CRISPR-Cas присущ ряд общих черт.
Локусы CRISPR могут выполнять функцию иммунитета только при наличии генов cas, которые обычно располагаются в непосредственной близости от CRISPR. Набор генов cas определяет тип системы CRISPR-Cas. Локусы CRISPR представлены короткими (обычно около 30—40 нуклеотидов длиной) прямыми повторами, которые отделяются друг от друга неповторяющимися спейсерами, произошедшими из ДНК тех чужеродных генетических элементов, с которыми сталкивалась клетка или её предшественники. Длина спейсеров обычно сопоставима с длиной повторов. Перед рядом повторов и спейсеров располагается лидерная последовательность, содержащая, как правило, промотор, с которого начинается однонаправленная транскрипция повторов и спейсеров CRISPR. Спейсеры полностью интегрированы в геном клетки и передаются её потомкам при делении. У бактерий интеграция новых спейсеров в геном сочетается с утратой избыточных и чужеродных генов; поэтому бактериям удаётся избежать значительного увеличения размера генома — в отличие от высших эукариот, у которых повторяющиеся последовательности, произошедшие из экзогенных генетических элементов, составляют существенную часть генома.
Кроме структурного сходства, различные системы CRISPR-Cas объединяют три ключевых этапа работы CRISPR-опосредованного иммунитета: приобретение (), или адаптация (), экспрессия () и интерференция (). На этапе приобретения в CRISPR встраивается новый спейсер, образованный из инородного генетического элемента, проникшего в клетку. На стадии экспрессии происходят транскрипция CRISPR и процессинг коротких CRISPR-РНК (crРНК), нацеленных на определённую мишень. В ходе интерференции рибонуклеопротеиновый комплекс crРНК-Cas распознаёт нуклеиновую кислоту-мишень за счёт комплементарного спаривания оснований мишени с crРНК, после чего разрезает мишень благодаря эндо- и/или экзонуклеазной активности белков Cas.
Интересно, что работа систем CRISPR-Cas имеет много общих принципиальных моментов с работой иммунной системы млекопитающих. Так, иммунизацию CRISPR (то есть вставку нового спейсера) может вызвать даже дефектный бактериофаг — подобно тому, как иммунный ответ млекопитающих может развиться и при введении убитого патогена.
Системы CRISPR-Cas могут передаваться от микроорганизма к микроорганизму с помощью горизонтального переноса генов. Противодействие вторжению в бактерию чужеродных генетических элементов не всегда оказывается полезным для бактерии. Например, у бактерии может наблюдаться снижение устойчивости к антибиотикам, обусловленное уничтожением системой CRISPR-Cas тех конъюгативных плазмид, которые обеспечивали эту устойчивость. У Staphylococcus aureus пониженное количество локусов CRISPR приводит к увеличению числа профагов, плазмид и мобильных генетических элементов в клетке, что усиливает вирулентность бактерии. Впрочем, локусы CRISPR-Cas, препятствующие распространению полезных в данных условиях мобильных генетических элементов, могут исчезать.
Приобретение спейсеров