Плазми́ды () — небольшие молекулы ДНК, физически обособленные от хромосом и способные к автономной репликации. Главным образом плазмиды встречаются у бактерий, а также у некоторых архей и эукариот (грибов и высших растений). Чаще всего плазмиды представляют собой двухцепочечные кольцевые молекулы. Несмотря на способность к размножению, плазмиды, как и вирусы, не рассматриваются в качестве живых организмов.
Размеры плазмид варьируют от менее чем 1 тысячи до 400—600 тысяч пар оснований (п. о.). Некоторые плазмиды содержатся в клетке в количестве одной-двух копий, другие — в количестве нескольких десятков. Плазмиды разных классов могут сосуществовать в клетке.
В природе плазмиды обычно содержат гены, повышающие приспособленность бактерий к окружающей среде (например, обеспечивают устойчивость к антибиотикам). Нередко они могут передаваться от одной бактерии к другой того же вида, рода, семейства и даже между клетками бактерий и растений, являясь таким образом средством горизонтального переноса генов. Перенос плазмиды в клетку может осуществляться двумя путями: либо при непосредственном контакте клетки-хозяина с другой клеткой в процессе конъюгации, либо путём трансформации, то есть захвата экзогенной ДНК из внешней среды.
Искусственные плазмиды используются как векторы в клонировании ДНК, причём благодаря их способности к репликации обеспечивается возможность репликации рекомбинантной ДНК в клетке-хозяине.
Физические характеристики
Размеры и численность
Величина плазмид различна. Если самые маленькие плазмиды содержат менее 2 тысяч пар оснований, то так называемые мегаплазмиды включают сотни тысяч пар оснований (обычно до 600 тыс.). В этом случае уже сложно провести чёткую границу между мегаплазмидой и . Некоторые виды бактерий могут одновременно содержать множество различных плазмид, так что их суммарный генетический материал превосходит по размеру таковой у самой бактерии. Например, симбиотическая почвенная бактерия содержит 3 репликона размером 3,65, 1,68 и 1,35 миллиона п. о. (мегабаз) соответственно вдобавок к её собственной хромосоме (6,69 мегабазы).
Мелкие плазмиды, содержащиеся в клетке в большом количестве копий, реплицируются независимо от бактериальной хромосомы, хотя существуют системы, контролирующие их численность. При некоторых условиях, например, при подавлении синтеза белка, бактериальная хромосома уже не может удваиваться, а плазмиды активно реплицируются и их численность увеличивается. Этот феномен используют при выделении плазмидной ДНК. Мегаплазмиды, к числу которых относится, например, F-плазмида, содержатся в клетке в виде одной или двух копий. Их репликация контролируется так же, как репликация бактериальной хромосомы, и при запуске удвоения геномной ДНК мегаплазмида также начинает реплицироваться.
Хотя в большинстве случаев плазмиды автономны, некоторые из них могут встраиваться в геномную ДНК бактерии-хозяина, а при определённых условиях вновь обособляться, иногда даже захватывая с собой фрагменты геномной ДНК. Такие плазмиды называют эписомами.
Конкретные механизмы репликации плазмид рассматриваются ниже.
Геометрия
Большинство плазмид — кольцевые молекулы, но известно и много примеров бактерий с линейными плазмидами. Поскольку линейным плазмидам необходим механизм репликации концов, которого нет у кольцевых хромосом, эти плазмиды обычно имеются у бактерий, содержащих также линейные хромосомы (хотя из этого правила известны исключения).
Кольцевые плазмиды могут иметь более одной топологической конфигурации, что обеспечивается соотношением противоположного действия ДНК-гираз и топоизомераз. Обычно плазмидная ДНК находится в виде ковалентно замкнутого суперскрученного кольца. Если одна из цепей ДНК претерпевает разрыв, то суперскрученная плазмида расплетается в простое кольцо, которое при электрофорезе медленнее, чем суперскрученная форма, проходит через агарозный гель. Если разрыв претерпевают обе цепи ДНК, то образуется линейная форма. Кроме того, из-за гомологичной рекомбинации плазмидные мономеры могут объединяться в димеры, которые из-за своих более крупных размеров медленнее мономеров проходят в агарозном геле при электрофорезе. Явление различной скорости прохождения различных форм плазмид через агарозный гель при электрофорезе используется для их электрофоретического разделения.
В нижеследующей таблице приведены некоторые плазмиды и их основные физические характеристики. Плазмида Хозяин Размер плазмиды (тыс. пар оснований) Геометрия плазмиды Число копий плазмиды на клетку pUB110 Bacillus subtilis 2,3 Кольцевая 20—50 ColEl Escherichia coli 6,6 Кольцевая 10—30 lp25 24,2 Линейная 1—2 pNOB8 sp.a (архея) 41,2 Кольцевая 2—40 F Escherichia coli 99,2 Кольцевая 1—2 SCP1 350,0 Линейная 4 pSymA Sinorhizobium meliloti 1354,2 Кольцевая 2—3
Строение Для того, чтобы быть способной к репликации, любая плазмида должна включать следующие элементы: точка начала репликации (ori); структурные гены репликации (rep); локус cop, содержащий гены, ответственные за ; гены par, контролирующие распределение плазмид между дочерними клетками при делении; детерминанты ccd, ответственные за поддержание числа копий.
Количество сайтов ori варьирует. У плазмиды он один, а у R6K — целых три. Как правило, при наличии нескольких ori функционирует преимущественно один, а остальные являются резервными на случай повреждения основного. У большинства плазмид вблизи ori находятся повторяющиеся последовательности, которые строго необходимы для функционирования ориджина.
Гены rep кодируют белки (Rep), которые участвуют в инициации репликации плазмиды, связываясь с ori. Однако основная часть генов, продукты которых участвуют во всех этапах репликации плазмиды, находится в геномной ДНК бактерии. Белки Rep разных плазмид имеют различные аминокислотные последовательности и структуры, но последовательности Rep-белков малых плазмид pPF1, pGL3, pPBS1, pBLX и pPB1 совпадают на 98 %. Существуют плазмиды, полностью лишённые генов rep.
В состав локуса cop входят один или два гена, отрицательно влияющих на количество копий плазмиды в клетке. В этом локусе обнаружены пять повторов, сходных с повторами около ориджина репликации. С этими повторами связывается белок repE, из-за чего он не может взаимодействовать с ori, что препятствует инициации репликации. Гены par (от ) отвечают за распределение копий плазмид по дочерним клеткам при делении материнской клетки. У F-плазмиды локус состоит из примерно 3 тысяч п. о. и содержит два гена: parA и parB, причём белковый продукт гена parB играет вспомогательную роль. Детерминанты ccd, по сути, представляют собой систему токсин-антитоксин, из-за которой клетки, не унаследовавшие плазмиду при делении, погибают. В разных плазмидах могут присутствовать и другие структурные гены помимо упомянутых.
Репликация
Как отмечалось выше, важным свойством плазмид является их способность к автономной репликации, в той или иной мере проходящей под контролем бактериальной хромосомы. Механизмы этого контроля подробнее освещены ниже.
Этапы репликации В репликации плазмид выделяют 3 этапа: инициация; элонгация; терминация.
Так как ДНК-полимераза не может начинать репликацию , то есть с нуля, для начала её работы требуется затравка — праймер. Эта проблема решается следующими способами: открытие цепей и последующее РНК-праймирование (репликация по тета-механизму или репликация по механизму замещения цепи); разрыв одной из цепей с образованием свободного 3'-ОН-конца (репликация по типу катящегося кольца). Наиболее часто инициация катализируется несколькими инициаторными белками, кодируемыми плазмидой, которые узнают определённый сайт на ДНК плазмиды и таким образом определяют точку начала репликации (ori). В некоторых случаях эти белки также непосредственно участвуют в создании праймера. Они также могут играть роль направляющих белков в сборке реплисомы плазмиды.
Элонгацию обычно осуществляет холофермент ДНК-полимеразы III (в некоторых случаях на ранней стадии — ) при участии некоторых белков хозяйской клетки, входящих в состав реплисомы.
Контроль репликации
Если плазмида содержится в клетке в большом количестве копий, она, скорее всего, будет передаваться всем дочерним клеткам при делении. Однако количество копий плазмид, которые могут содержаться в одной клетке, всё-таки ограничено. Удвоение плазмиды очень затратно для клетки с метаболической точки зрения, поэтому, если затраты станут особенно велики, естественный отбор будет способствовать сокращению численности плазмид.
Механизмы контроля репликации работают на стадии инициации репликации. Эти механизмы поддерживают определённую частоту циклов репликации на плазмиду в данной клетке и способны чувствовать отклонения от этой частоты. Системы контроля обеспечивают поддержание определённой численности плазмид в популяции бактерий. Молекулами, непосредственно его осуществляющими, могут быть: РНК с противоположной полярностью (антисмысловые РНК); последовательности ДНК (итероны); антисмысловые РНК вместе с белками.
Итероны — это короткие (17—22 п. о.) повторяющиеся последовательности ДНК, которые находятся вблизи точки начала репликации плазмиды. С итеронами связывается белок RepA. Если в клетке имеется больше одной копии плазмиды, то RepA связывается и со второй копией. В результате две плазмиды оказываются связаны друг с другом, что не даёт им удваиваться.
С помощью антисмысловых РНК регулируется репликация, например, плазмиды R100. Белок RepA в данном случае выступает как положительный регулятор репликации, поскольку он необходим для её инициации. Экспрессия RepA находится под контролем антисмысловой РНК CopA, которая связывается с мРНК RepA и подавляет его трансляцию. Кроме того, транскрипция гена repA репрессируется белком CopB. Когда плазмида только попадает в клетку, CopB там нет, и начинается экспрессия RepA и репликация плазмиды. Однако постепенно начинает экспрессироваться и CopB, который сдерживает дальнейшую репликацию.
Некоторые белки, инициирующие репликацию плазмид, могут делать это лишь единожды. Так, при инициации репликации плазмиды pT181 инициаторные белки Rep формируют димеры RepC/RepC, а при терминации репликации один из мономеров подвергается посттрансляционным модификациям, которые делают его нефункциональным.
Некоторые плазмиды, например, ColE1, экспрессируют ингибитор собственной репликации. Концентрация белка-ингибитора в клетке напрямую зависит от количества копий плазмид, поэтому он сдерживает численность плазмиды в клетке.
Механизмы репликации
Репликация по тета-механизму
Этот механизм, сопровождающийся образованием так называемой , хорошо изучен у плазмид грамотрицательных бактерий, хотя такой механизм описан и у плазмид грамположительных бактерий: плазмид стрептококков/энтерококков семейства Inc18, некоторых репликонов и у как минимум одной плазмиды Bacillus subtilis.
Репликация по тета-механизму включает в себя следующие этапы: расплетание двух родительских цепей; синтез праймерной РНК (пРНК) на каждой из них; инициация репликации при помощи ковалентного нарастания пРНК на каждой из них; синтез комплементарной цепи ДНК на каждой из родительских цепей. Одна из цепей при этом выступает лидирующей, другая — отстающей, хотя синтез цепей происходит одновременно.
Тета-репликация может начинаться одновременно с одной или нескольких точек и быть при этом одно- или двунаправленной. В электронный микроскоп репликационная структура выглядит как греческая буква Θ (тета), отчего и называется тета-структурой. Если же специальные ферменты разрезают эту структуру в точке начала репликации, то получается Y-образная структура («вилка»). Репликационные структуры также можно определить при одно- или двумерном электрофорезе. Этот анализ позволяет установить природу репликационных соединений, направление репликации, точки начала и конца репликации, угол между лидирующей и отстающей цепями.