Allium test — растительная тест-система для оценки мутагенного, митозмодифицирующего и токсического эффектов факторов химической и физической природы на основе растения (сорт Штутгартен).
В Allium test используются корешки проростков репчатого лука Allium cepa, который впервые предложен Шведской королевской академией наук как стандартный тест-объект.
В современных исследованиях Allium cepa L. считается эталонным растительным тест-объектом для анализа мутагенности, митотоксичности и токсичности различных факторов. Наряду с Allium test используются и другие тест-объекты (среди растений наиболее часто — горох Pisum sativum и бобы Vicia faba).
Данный метод является простым, экономичным, быстрым и достаточно чувствительным для определения «мутаген» или «не мутаген» фактор, «цитотоксичен» или «не цитотоксичен».. Allium test рекомендован для исследования практически любых химических, физических и биологических факторов. По мере синтеза новых веществ тест получает новые рекомендации, что делает его одним из наиболее популярных.
Allium test рекомендован экспертами ВОЗ как стандарт в цитогенетическом мониторинге окружающей среды, так как результаты, полученные на данном тесте, показывают корреляцию с тестами на других организмах: водорослях, растениях, насекомых, в том числе и млекопитающих и человеке. Рекомендован в качестве альтернативы генотоксикологическим тестам на лабораторных животных (в том случае если для одних и тех же исследуемых веществ наблюдается одинаковый результат в данном тесте и тестах на животных, то есть если показана корреляция).
История метода История биотеста Allium test началась более 70 лет назад. Автор методики — академик Шведской Королевской Академии Наук, доктор Альберт Леван (1905—1998). Известен своими работами по цитогенетике, генотоксикологии, онкогенетике, а также тем, что в 1956 г. совместно с Джо Хин Тио определил хромосомный набор человека.
Альберт Леван шёл к созданию Allium test постепенно. В 1929—1937 гг. Леван изучал морфологию и набор хромосом у ряда представителей рода Allium. При этом он руководствовался трудами многих выдающихся учёных: Эдварда Регеля, Эдуарда Страсбургера, Генриха Шаффнера Георга Тишлера, Эмиля Хайца, Эдмунда Уилсона, Михаила и Сергея Навашиных, Григория Левицкого и многих других. Опираясь на их работы и на свои собственные труды, Альберт Леван сделал вывод, что идеальным объектом для детальных цитогенетических исследований является A. cepa. Главная причина, по которой был сделан выбор, заключается в том, что у данного вида «превосходное состояние хромосом». Луковицы быстро прорастают и легко доступны круглый год. Для изучения митоза он выбрал корневые меристемы.
В 1937 г. в журнале Science выходит сенсационная статья А. Ф. Блэксли и А. Г. Айвери о новом методе, который позволяет получать ценные полиплоидные растения после обработки семян колхицином. В том же году, в журнале Nature выходит работа Б. Р. Небеля, который независимо пришёл к тем же выводам.
В 1938 г. Альберт Леван, развивая их идеи, проводит собственное исследование. В нескольких сериях экспериментов он воздействовал колхицином на корневые меристемы A. cepa и регистрировал к митоз — клетки значительно увеличивались в размерах, и происходило умножение количества хромосом. Визуальное проявление к митоза, которое он наблюдал — «опухолевидное» утолщение кончиков корней. В 1945 г. Леван опубликовал статью в журнале Nature, в которой он показывает, что соли 25 металлов способны вызывать различные типы хромосомных аберраций в корневых меристемах у A. cepa. Им изучен эффект воздействия аценафтола, хлороформа, уксусно нафталиновой кислоты и многих других соединений. В 1949 г. Альберт Леван пишет о новом методе в цитогенетике и даёт ему название Allium test. Ранний вариант метода включал лишь анализ к митоза в профазах. В более поздних работах Альберт Леван начал регистрировать фрагменты и мосты, и выделил их в отдельную категорию «радиомиметических эффектов». Леван считал, что результаты, полученные в Allium test, являются важным индикатором для более глубоких исследований по мутагенезу и канцерогенезу.
Наряду с Леваном к идее о создании метода Allium test, аналогичным путём пришли и другие учёные. В 1941 г. Карл Сакс из Гарвардского Университета изучал влияние рентгеновских лучей на корневые меристемы A. cepa и регистрировал различные хромосомные нарушения. В 1948 г. Франциско Д`Амато из Пизанского Университета установил, что целый ряд химических соединений вызывает митотоксический эффект. Д`Амато разработал «тест на проростках лука» и вместе с коллегами исследовал цитогенетические эффекты более чем 40 химических веществ. В том же году выходит статья Леона Вандерлина (1948), который пишет о митозах в корневых меристемах A. cepa, как о классической модели митоза в цитогенетике.
В 1973 г. Шведская Королевская Академия Наук рекомендовала Allium test в качестве стандартного скрининг-теста. Основаниями для этого послужили его быстрота, экономичность и простота исполнения, а ещё «отличное состояние хромосом» у A. cepa L. Как сообщает В. Грант, к 1982 г. с помощью метода Allium test был исследован генотоксический потенциал более чем 148 химических соединений. На основании этого В. Грант делает вывод о необходимости включения Allium test в список стандартных генетико-токсикологических тестов, что и было сделано экспертами ВОЗ в 1985 г.
В 1979—1985 гг. Г. Фискесджо, ученик А. Левана развивает и адаптирует метод для оценки различных химических соединений. Уделяет большое внимание не только учёту частоты хромосомных аберраций, но и измерению длины корней, как показателя токсического действия исследуемого фактора, который напрямую связан с микропараметрами. Фискесджо отмечает, что чувствительность Allium test практически не отличается от чувствительности теста на лимфоцитах человека. Вот его собственная оценка данного метода: Растения легки для хранения и ухода, широко распространены и недорогие. Вообще, состояние хромосомы клеток растения — хорошее, поэтому обеспечивает высокое качество в контрольных условиях. Биотест Allium cepa является относительно быстрым, лёгким для выполнения испытаний, а также высокочувствительным и воспроизводимым. Это также обеспечивает сходимые результаты с целым рядом других тестовых систем. Как макроскопический, так и микроскопический эффекты, обладают хорошей корреляцией между собой. Макроскопический эффект (сдерживание корневого прироста) является самым чувствительным параметром. Сдерживание прироста является следствием прямых или косвенных вредных эффектов. Микроскопическое исследование позволяет оценить повреждения хромосом и нарушения деления клеток, и поэтому обеспечивает дополнительную информацию относительно остроты, механизма генотоксического эффекта или потенциальной мутагенности. Корневые клетки обладают определёнными ферментами, выполняющими функции оксидаз, которые способствуют превращению многих не мутагенных веществ в мутагенные. Эта система активации позволяет обнаружить те химические вещества, которые усиливают свой токсический эффект в процессе метаболизма. Система имеет широкий ряд применений, например, для проверки химической чистоты питьевой, природной воды, а также промышленного ущерба и т. п., и полезен для оценки и классификации экологических химикатов с ссылкой на токсичность. Биотест может также использоваться для измерения относительной токсичности нерастворимых в воде соединений, при условии, что они могут быть растворены в подходящем растворителе, а затем разбавлены в воде таким образом, что остаточная концентрация не превысит определённых пределов. В таких случаях для контроля растворителей должен также быть организован тестовый режим. Биотест действует в широком диапазоне pH (3,5 — 11,0) без каких-нибудь очевидных эффектов на приросте корневых систем. Поэтому умеренно кислые/щелочные образцы воды, химические растворы, и т. п. могут быть исследованы без необходимой корректировки pH. Биотест с использованием Allium cepa высокочувствителен и может дать позитивные токсические эффекты в случаях, когда исследуемые пробы проверены в других системах (особенно высшие организмы, как например рыбы) и по их результатам не токсичны. Позитивные результаты в этой тестовой системе указывают потенциальный биологический риск. Экстраполяция результатов от одной тестовой системы к другой (и в конечном счете к человеку) должна быть основанной на результатах серии испытаний и с должным рассмотрением к метаболическим превращениям тестируемого образца. В сравнении с другими краткосрочным альтернативным биотестами на токсичность этот тест показал хорошую сходимость с результатами других тестовых систем, использующих множество других организмов как эукариотов, так и прокариотов. Результаты таких сравнений описаны ниже: В кольцевом тесте, где для изучения веществ использовались в качестве тестовых систем различные микроорганизмы независимыми лабораториями, те же самые вещества были предложены для тестирования и на Allium test-e. Среди этих микроорганизмов 16 различных морских водорослях (зеленые морские водоросли и кремнёвые морские водоросли), дрожжах (Saccharomyces cerevisiae), простейших (Tetrahymena pyriformis) и микроорганизмы активного ила(сообщество бактерий, дрожжей и простейших). Результаты были в целом хорошо сравнимы, хотя были видимы некоторые отличия в чувствительности. Большинство морских водорослей были чувствительнее, чем Allium сера, тогда как дрожжи, простейшие и тест на активном иле были менее чувствительны. Целый ряд водных растений и животных оказался менее чувствительным к определённым классам веществ сравнению с биотестом Allium например рыбы (Gasterosteus aculeatus), водные животные (Daphnia magna, Brachydario rerio — яйца или икра бактерии Microtox) и растения (одноклеточные морские водоросли). Другие животные (например. Nitocra spinipes) и растения (напр. морские водоросли и одноклеточные) представляют сопоставимые результаты рассматриваемому биотесту В исследованиях на бензопирен китайская система с использованием клеток хомяка V79 без учёта метаболических эффектов системы активизации являются менее чувствительными, чем Allium сера. Относительная чувствительность меняется с учётом влияния функций оксидаз. Несмотря на изменения в чувствительности общие результаты между двумя системами сравнимы. Испытания, проведённые на человеческих лимфоцитах, которые оказались немного более чувствительными к эффектам органических ртутных соединений, чем клетки меристемы корней Allium cepa, в целом однотипны. Изучение микроскопических параметров обеих клеток дают подобный эффект (c-митоз). Биотестирование с помощью Allium сера, в данном случае, является лучшим методом определения экологического риска за счёт его высокой чувствительности.
Дж. Ранком и М. Г. Нельсоном (1993) была предложена модификация ана-телофазного анализа, в котором определяются три типа хромосомных нарушений: фрагменты, мосты и отставания хромосом. Авторы рекомендовали использовать луковицы A. cepa сорта Штутгартен-Ризен. Дж. Ранк (2003) показывает 82 % корреляцию между чувствительностью Allium test и тестом на грызунах по отношению к химическим веществам (в частности к пестицидам). Также он отмечает, что чувствительность Allium test при исследовании сточных вод выше, чем в тесте Эймса.
В 1995 г. Т.-Х. Ма была предложена модификация, в которой мутагенный эффект оценивался путём учёта частоты микроядер. Совместный анализ хромосомных аберраций и микроядер был предложен Д. М. Леме и М. А. Марин Моралес (2008) как существенный показатель прямого действия химического фактора на ДНК. Аналогичный метод в 2013 г. был предложен Д. С. Песня и А. В. Романовским для оценки генотоксического и цитотоксического эффекта электромагнитных излучений.