В биологии активный центр — это область фермента, где молекулы субстрата связываются и подвергаются химической реакции. Активный центр состоит из аминокислотных остатков, которые образуют временные связи с субстратом (сайт связывания), и остатков, которые катализируют реакцию этого субстрата (каталитический сайт). Хотя активный центр занимает только ~ 10-20 % от объёма фермента , он является наиболее важной частью, поскольку он непосредственно катализирует химическую реакцию. Обычно активный центр состоит из сайта связывания (десять-пятнадцать аминокислот), связывающего и ориентирующего субстраты, и катилитического сайта из трех-четырёх аминокислот, непосредственно снижающий энергию химической активации для реакции, в то время как другие аминокислоты в белке необходимы для поддержания его третичной структуры .
Каждый активный центр эволюционно развивался для оптимизации связывания с конкретным субстратом и катализирования конкретной реакции, что приводит к высокой специфичности ферментов. Эта специфичность определяется расположением аминокислот в активном центре и структурой субстратов. Иногда ферментам также необходимо связываться с некоторыми кофакторами для выполнения своей функции (например кофактор - гидратированный ион магния необходим для помощи в разрыве фосфатидной связи в АТФ в фосфатазах ) . Активный центр обычно представляет собой бороздку или карман у фермента, которые могут располагаться в глубоком туннеле внутри фермента или в межфазных границах у мультимерных ферментов. Активный центр может повторно катализировать реакцию, поскольку его аминокислотные остатки не изменяются в конце реакции (они могут изменяться во время реакции, но регенерируются к её концу). Этот процесс достигается за счет снижения энергии активации реакции, поэтому большее количество субстратов имеет достаточно энергии для прохождения реакции.
Сайт связывания
Обычно молекула фермента имеет только два активных центра, и эти активные центры соответствуют одному конкретному типу субстрата. Активный центр содержит сайт связывания, который связывает субстрат и ориентирует его для катализа. Ориентация субстрата и непосредственная близость между ним и активным центром настолько важны, что в некоторых случаях фермент все ещё может функционировать должным образом, даже если все другие его части мутировали и потеряли функцию.
Первоначально взаимодействие между активным центром и субстратом нековалентное и временное. Существует четыре важных типа взаимодействия, которые удерживают субстрат в определённой ориентации и образуют комплекс фермент-субстрат (комплекс ES): водородные связи, Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия, гидрофобные взаимодействия и электростатические силовые взаимодействия . Распределение заряда на субстрате и активном центре должно быть комплементарным, что означает, что все положительные и отрицательные заряды должны быть нейтрализованы. В противном случае их будет раздвигать отталкивающая сила. Активный центр обычно содержит неполярные аминокислоты, хотя иногда могут встречаться и полярные аминокислоты. Связывание субстрата с сайтом связывания требует по крайней мере трех точек контакта для достижения стерео-, регио- и энантиоселективности. Например, алкогольдегидрогеназа, которая катализирует перенос гидрид- иона от этанола к НАД+, взаимодействует с метильной группой субстрата, гидроксильной группой и про-(R) водородом, который будет отводиться во время реакции .
Для того чтобы выполнять свою функцию, ферменты должны принять правильную белковую укладку (нативную укладку) и третичную структуру. Чтобы поддерживать заданную трехмерную структуру, белки полагаются на различные типы взаимодействий между своими аминокислотными остатками. Если этим взаимодействиям препятствуют, например, экстремальные значения pH, высокая температура или высокие концентрации ионов, это приведет к денатурированию фермента и потере его каталитической активности.
Считается, что более плотное соединение между активным центром и молекулой субстрата увеличивает эффективность реакции. Если плотность между активным центром ДНК-полимеразы и её субстратом увеличивается, точность, то есть скорость правильной репликации ДНК, также увеличивается. Большинство ферментов имеют глубоко погруженные активные центры, к которым субстрат может получить доступ только через каналы доступа.
Предлагаются три модели того, как ферменты соответствуют своему конкретному субстрату: модель замка и ключа, модель индуцированного соответствия и модель конформационного отбора. Последние два не исключают друг друга: конформационный отбор может сопровождаться изменением формы фермента. Кроме того, белок не может полностью соответствовать ни одной из моделей. Аминокислоты в сайте связывания убиквитина обычно следуют модели индуцированного соответствия, тогда как остальной белок обычно придерживается модели конформационного отбора. Факторы, такие как температура, вероятно, влияют на путь, осуществляемый во время связывания, причем более высокие температуры, по прогнозам, увеличивают важность конформационного отбора и уменьшают важность индуцированного соответствия.
Гипотеза «замок и ключ» Эту концепцию предложил химик XIX века Эмиль Фишер. Он предположил, что активный центр и субстрат представляют собой две стабильные структуры, которые идеально подходят без каких-либо дополнительных изменений, точно так же, как ключ вставляется в замок. Если один субстрат идеально связывается со своим активным центром, взаимодействия между ними будут самыми сильными, что приведет к высокой каталитической эффективности.
Со временем начали проявляться ограничения этой модели. Например, конкурентный ингибитор фермента метилглюкозид может прочно связываться с активным центром 4-альфа-глюканотрансферазы и идеально в него вписываться. Однако 4-альфа-глюканотрансфераза не активна в отношении метилглюкозида, и перенос гликозила не происходит. Гипотеза замка и ключа не может этого объяснить, поскольку она предсказывает высокую эффективность переноса метилглюкозид-гликозила из-за его прочного связывания. Помимо конкурентного ингибирования, эта теория не может объяснить механизм действия неконкурентных ингибиторов, поскольку они не связываются с активным центром, но, тем не менее, влияют на каталитическую активность.
Гипотеза индуцированной подгонки Теория связывания фермента с субстратом Дэниела Кошланда состоит в том, что активный центр и связывающая часть субстрата не совсем комплементарны. Модель индуцированной подгонки является развитием модели с замком и ключом и предполагает, что активный сайт является гибким и меняет форму до тех пор, пока субстрат не будет полностью связан. Эта модель похожа на человека, надевающего перчатку: перчатка меняет форму, чтобы соответствовать руке. Фермент изначально имеет конформацию, которая привлекает его субстрат. Поверхность фермента гибкая, и только правильный катализатор может вызвать взаимодействие, ведущее к катализу. При связывании субстрата могут происходить конформационные изменения. После того, как продукты реакции отойдут от фермента, активный центр вернется к исходной форме. Эта гипотеза подтверждается наблюдением, что весь белковый домен может перемещаться на несколько нанометров во время катализа. Движение белковой поверхности может создавать микроокружение, способствующее катализу.
Гипотеза конформационного отбора Эта модель предполагает, что ферменты существуют во множестве конформаций, только некоторые из которых способны связываться с субстратом. Когда субстрат связан с белком, равновесие в конформационном ансамбле смещается в сторону тех, которые способны связывать лиганды (поскольку ферменты со связанными субстратами удаляются из равновесия между свободными конформациями).
Типы нековалентных взаимодействий
Электростатическое взаимодействие: в водной среде противоположно заряженные группы в боковых цепях аминокислот в активном центре и субстратах притягиваются друг к другу, что называется электростатическим взаимодействием. Например, когда карбоновая кислота (R-COOH) диссоциирует на ионы RCOO- и H+, COO- будет притягивать положительно заряженные группы, такие как протонированная гуанидиновая боковая цепь аргинина.
Водородная связь: водородная связь — это особый тип диполь-дипольного взаимодействия между частично положительным атомом водорода и частично отрицательным донором электронов, которые содержат пару электронов, таких как кислород, фтор и азот. Прочность водородной связи зависит от химической природы и геометрического расположения каждой группы.
Сила Ван-дер-Ваальса: сила Ван-дер-Ваальса образуется между противоположно заряженными группами из-за временного неравномерного распределения электронов в каждой группе. Если все электроны сосредоточены на одном полюсе группы, этот конец будет отрицательным, а другой конец — положительным. Хотя индивидуальная сила группы мала, общее количество данных взаимодействий между активным центром и субстратом велико, поэтому их сумма может быть значительной.
Гидрофобное взаимодействие: неполярные гидрофобные группы имеют тенденцию агрегироваться вместе в водной среде и пытаться уйти из полярного растворителя. Эти гидрофобные группы обычно имеют длинную углеродную цепь и не реагируют с молекулами воды. При растворении в воде молекула белка сворачивается в шарообразную форму, оставляя гидрофильные группы снаружи, в то время как гидрофобные группы погружаются глубоко в центр.
Каталитический сайт
После связывания субстрата с активным центром и его ориентации можно начинать катализ. Аминокислотные остатки каталитического центра обычно очень близки к сайту связывания, и некоторые остатки могут играть двойную роль как в связывании, так и в катализе. Они взаимодействуют с субстратом, чтобы снизить энергию активации реакции и тем самым ускорить её протекание. Снижение энергии активации может происходить с помощью различных механизмов, включая: приближение реагентов, нуклеофильный / электрофильный катализ и кислотно-основной катализ.
Механизмы, участвующие в каталитическом процессе
Приближение реагента Во время ферментативной каталитической реакции субстрат и активный центр находятся в непосредственной близости. Этот подход преследует разные цели. Во-первых, когда субстраты связываются внутри активного центра, его эффективная концентрация значительно увеличивается, чем в растворе. Это означает, что количество молекул субстрата, участвующих в реакции, также увеличивается. Этот процесс также снижает энергию десольватации, необходимую для протекания реакции. В растворе молекулы субстрата окружены молекулами растворителя, и молекулам фермента требуется энергия для их замены и контакта с субстратом. Поскольку объёмные молекулы могут быть исключены из активного центра, этот выход энергии может быть минимизирован. Далее, активный центр участвует в переориентации субстрата для уменьшения энергии активации реакции. Выравнивание субстрата после связывания блокируется в состоянии высокой энергии и может переходить к следующему этапу. Кроме того, этому связыванию способствует энтропия, поскольку затраты энергии, связанные с реакцией в растворе, в значительной степени устраняются, поскольку растворитель не может попасть в активный центр. В конце концов, активный центр может манипулировать молекулярной орбиталью субстрата в подходящей ориентации для снижения энергии активации .
Электростатические состояния субстрата и активного центра должны дополнять друг друга. Поляризованная отрицательно заряженная боковая цепь аминокислоты отталкивает незаряженный субстрат. Но если переходное состояние включает образование ионного центра, тогда боковая цепь будет производить благоприятное взаимодействие.
Ковалентный катализ