Количественный анализ нуклеиновых кислот — определение концентрации ДНК или РНК в смеси или чистом препарате. Реакции с участием нуклеиновых кислот часто требуют точных сведений о количестве и чистоте препарата. Для определения концентрации нуклеиновой кислоты в растворе используют спектрофотометрический метод и УФ-флюоресценцию, если нуклеиновая кислота содержит краситель.

Спектрофотометрический анализ Нуклеиновые кислоты определенным образом поглощают ультрафиолет. В спектрофотометрах образец подвергается действию ультрафиолета с длиной волны 260 нм, а фотодетектор измеряет количество света, прошедшего через образец. Чем больше света поглощено, тем выше концентрация нуклеиновой кислоты в образце.

При помощи закона Бугера — Ламберта — Бера возможно соотнести концентрацию молекул, поглощающих излучение, с количеством поглощенного света. На длине волны 260 нм средний коэффициент экстинкции для двуцепочечной ДНК составляет 0,020 (мкг/мл)−1 см−1, для одноцепочечной ДНК 0,027 (мкг/мл)−1 см−1, для одноцепочечной РНК 0,025 (мкг/мл)−1 см−1 и для коротких одноцепочечных олигонуклеотидов коэффициент экстинкции зависит от длины и соотношения азотистых оснований (около 0,030 (мкг/мл)−1 см−1). Отсюда, оптическая плотность () равная 1, соответствует концентрации двуцепочечной ДНК около 50 мкг/мл. Спектрофотометрический способ определения концентрации нуклеиновых кислот применяется при концентрациях до 2 OD. Более точные коэффициенты экстинкции требуются для определения концентрации олигонуклеотидов, и могут быть предсказаны при помощи модели ближайшего соседства.

Коэффициенты пересчета Тип нуклеиновой кислоты Концентрация (мкг/мл) для 1 единицы A260 dsDNA (двуцепочечная ДНК) 50 ssDNA (одноцепочечная ДНК) 37 ssRNA (одноцепочечная РНК) 40

Кюветы для анализа Для определения концентрации образца найденную в стандартной кювете с величиной оптического пути 10 мм оптическую плотность необходимо разделить на соответствующий коэффициент. Например, величина поглощения 0,9 оптических единицы двуцепочечной ДНК соответствует концентрации 45 мкг/мл.

Кюветы малого объема Для многих биологических исследований (ДНК-микрочип, количественная ПЦР) требуется качественное и количественное определение малых объемов нуклеиновых кислот. Специальные нанофотометрыKartha, R. Spectrophotometric Quantification of Nano- and Standard-Volume Samples, (2008, October 7), American Biotechnology Laboratory, http://www.iscpubs.com/Media/PublishingTitles/b0608kar.pdf позволяют определять концентрации образцов без помощи кюветы в субмикролитровых объемах, начиная от 0,3 мкл. Так как производятся измерения неразбавленного образца, воспроизводимость результатов очень высокая, а сами образцы могут быть использованы после анализа.

Чистота образца Часто образцы нуклеиновых кислот содержат примеси белков и других органических веществ. Отношение поглощения на длинах волн 260 и 280 нм (A260/280) часто используют для оценки чистоты препарата. Чистая ДНК имеет соотношение A260/280 порядка 1,8, образец РНК без примесей A260/280 около 2.

Примеси белков и отношение 260:280 Для выявления примесей белков в растворах нуклеиновых кислот, анализируют соотношение поглощения растворов на длинах волн 260 и 280 нм, так как ароматические аминокислоты в составе белков поглощают на 280 нмSambrook and Russell cites the original paper: ). Однако влияние примесных белков на определение концентрации нуклеиновых кислот невелико — лишь при значительной концентрации белка соотношение 260:280 сдвигается существенно).

Отношение 260:280 позволяет определить примесь нуклеиновых кислот в растворах белков и примесей белков в растворах нуклеиновых кислот: % белка % нуклеиновой кислоты отношение 260:280100 0 0,5795 5 1,0690 10 1,3270 30 1,73

Отношение 260:230 имеет меньшую чувствительность при определении примеси белка в растворе нуклеиновой кислоты: % нуклеиновой кислоты % белка отношение 260:230100 0 2,0095 5 1,9990 10 1,9870 30 1,94

Такие отличия обусловлены более высоким значением коэффициента молярной экстинкции нуклеиновых кислот на длинах волн 260 и 280 нм в сравнении с белками. Поэтому даже для раствора белка относительно высокой концентрации вклад в поглощение на длинах волн 260 и 280 нм небольшой. Белковое загрязнение в растворе нуклеиновой кислоты не может быть определено по соотношению 260:230.

Другие загрязнения Загрязнения фенолом, который часто используют при выделении нуклеиновых кислот, может приводить к значительным погрешностям при измерении концентрации нуклеиновых кислот. Фенол имеет максимальное поглощение на длине волны 270 нм и соотношение A260/280 около 1,2. Нуклеиновые кислоты, не содержащие фенол, имеют соотношение A260/280 около 2. Примеси фенола могут значительно завысить концентрацию ДНК. Поглощение на длине волны 230 нм может быть вызвано загрязнениями фенолятами, тиоцианатами и другими органическими соединениями. Для чистого образца РНК отношение A260/230 должно быть около 2, для чистого образца ДНК A260/230 около 1,8. Поглощение на длине волны 330 нм и выше указывает на другие загрязнения раствора. Поглощение на этих длинах волн для чистых препаратов нуклеиновых кислот должно быть равно нулю. Отрицательные значения могут быть вызваны неверным выбором раствора, использованного в качестве пустого (blank) либо быть следствием наличия флюоресцентного красителя в растворе.

Определение количества молекул ДНК или РНК с конкретными последовательностями нуклеотидов с помощью технологии SlipChip Для диагностических целей часто надо определить количество той или иной ДНК или РНК. Разработаны высокочувствительные методы определения ДНК и РНК в микрообъёмах образцов — каплях не превышающих несколько пиколитров. Для этого используются микрожидкостные устройства для ПЦР с одной копии нуклеиновой кислотыShen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., & Ismagilov, R. F. (2010). Digital PCR on a SlipChip. Lab on a Chip, 10(20), 2666—2672. Jesus Rodriguez-Manzano, Mikhail A. Karymov, Stefano Begolo, David A. Selck, Dmitriy V. Zhukov, Erik Jue, Rustem F. Ismagilov. Reading Out Single-Molecule Digital RNA and DNA Isothermal Amplification in Nanoliter Volumes with Unmodified Camera Phones . ACS Nano, 2016; Ahrberg, C. D., Ilic, B. R., Manz, A., & Neužil, P. (2016). Handheld real-time PCR device. Lab on a Chip., 16, 586—592 Available on 2017-01-26Zhao Li, Yong Liu, Qingquan Wei, Yuanjie Liu, Wenwen Liu, Xuelian Zhang, and Yude Yu1 (2016). Picoliter Well Array Chip-Based Digital Recombinase Polymerase Amplification for Absolute Quantification of Nucleic Acids. PLoS One.; 11(4): e0153359 .

Примечания

Категория:Фотометрия Категория:Методы молекулярной биологии Категория:Нуклеиновые кислоты