Транскрипто́мика одино́чных кле́ток () — область биологических исследований, в которой основным инструментом служат методы количественного анализа экспрессии генов в индивидуальных клетках. Изучение транскриптома отдельных клеток позволяет решить проблему «усреднённых» данных, которые получаются при анализе тотальной РНК, выделенной из образца. Секвенирование РНК одиночных клеток сделало возможными анализ клеточного многообразия в популяциях клеток, считавшихся ранее однородными, например, были получены новые данные в областях иммунологических, эмбриологических и онкологических исследований. Развитие технологий с 2009 года, когда впервые было произведено секвенирование транскриптома одиночных клеток, по наше время позволило увеличить производительность эксперимента от единиц до сотен тысяч клеток, что существенно повысило точность получаемых данных.
Технология анализа транскриптома единичных клеток с помощью количественной ПЦР Количественная ПЦР применяется для анализа транскриптома единичных клеток реже, чем секвенирование. Для проведения эксперимента требуется выделение одиночных клеток, их лизис, обратная транскрипция РНК. Этот метод достаточно чувствительный, он может быть использован на микрофлюидных технологиях, однако он не позволяет исследовать весь транскриптом, а только детектировать количество конкретных транскриптов, к которым подобраны зонды или праймеры. При этом уровень экспрессии изучаемых генов определяется не абсолютно, а относительно гена.
Количественная ПЦР может также применяться для валидации данных секвенирования РНК.
Технология секвенирования РНК отдельных клеток
Общий алгоритм секвенирования РНК одиночных клеток включает в себя 8 последовательных этапов: Выделение единичных клеток; Лизис единичных клеток; Выделение интересующей фракции РНК с помощью специальных праймеров; Синтез кДНК с помощью обратной транскрипции; Амплификация кДНК; Подготовка библиотеки кДНК; Секвенирование; Биоинформатическая обработка полученных и анализ данных.
Различные методы подготовки библиотек для секвенирования РНК одиночных клеток отличаются по своей специфичности, точности, стоимости и другим параметрам. Например, Smart-seq2 отличается высокой чувствительностью, а Drop-seq и другие микрофлюидные технологии с использованием микрочастиц очень высокопроизводительны.
Выделение отдельных клеток Перед разделением клеток нужно прервать контакты между ними и избавиться от межклеточного вещества. Это может быть достигнуто с помощью ферментирования образца ткани, а также путём специфических манипуляций, таких как, например, лазерная захватывающая микродиссекция, которая позволяет выделять клетки из образца твёрдой ткани с помощью лазера. После получения клеточной суспензии клетки разделяют с помощью различных методов. Метод предельного разбавления (). Этот метод заключается в том, что из разбавленной клеточной суспензии пипеткой выделяются отдельные клетки. Процедура производится вручную. Микроманипуляция (). Это метод ручного выделения клеток из ткани под микроскопом. Он обычно используется для выделения клеток ранних эмбрионов или отбора клеток некультивируемых микроорганизмов.
(). Это часто используемый высокопроизводительный метод. Перед сортировкой клетки метят с помощью моноклональных антител к поверхностным , антитела снабжены флуоресцентными метками. Механическая сортировка происходит следующим образом. Суспензию клеток помещают в прибор, который выбрасывает капли, содержащие по одной клетке, через наконечник специального «распылителя». Эти капли проходят через луч лазера, и, в зависимости от типа (или их совокупности) на клетке, капля получает заряд, который заставляет её притягиваться к одной из отклоняющих пластин, в результате чего она попадает в конкретный собирающий сосуд. Возможно также производить негативный отбор и выделять клетки, не несущие маркеров. Данный метод не позволяет работать с образцами малого объёма (требуется подавать на вход около 10000 клеток) и требует наличия антител к поверхностным белкам. Микрофлюидные технологии (). Это также высокопроизводительный метод, использующийся наряду с FACS. Он основан на изоляции клеток в микрокаплях буфера, погружённых в гидрофобную среду (масло). Разделение происходит в трубках, диаметр которых подобран так, чтобы капли, содержащие клетки, не сливались друг с другом. Капля раствора, в которую помещается клетка, содержит реакционную смесь для лизиса, выделения РНК и синтеза кДНК. Такой принцип используется в коммерческом аппарате Fluidigm C1 и позволяет обрабатывать до 1000 клеток параллельно. Микрофлюидные технологии с использованием микрочастиц (). Данный принцип также основан на изоляции клеток в гидрофильных микрочастицах жидкости в гидрофобной среде, но помимо клеток, в каплю попадает также твёрдая микрочастица с иммобилизированными на ней праймерами. Так же как и в предыдущем случае, в каплях содержатся изолированные клетки, лизирующий буфер и реакционная смесь для обратной транскрипции, в том числе изолированные на микрочастицах праймеры. Этот метод используется в коммерческом аппарате Chromium system from 10× Genomics. Он позволяет работать с каплями меньшего объёма, чем микрофлюидные технологии без микрочастиц, и обрабатывать от 1000 до 1000000 клеток. Микрофлюидные технологии с использованием микроячеек. Данный метод основан на распределении клеток по ячейкам такого размера, который допускает попадание в них не более одной клетки и микрочастицы с иммобилизованными праймерами. Выделение редких циркулирующих опухолевых клеток. Некоторые специфические задачи требуют выделения из популяции очень малочисленных клеток. Например, выделение из крови циркулирующих опухолевых клеток () производится с помощью добавления к образцу крови антител с магнитными частицами и выделения меченых клеток с помощью магнита. Для опухолевых клеток эпителиального происхождения используются антитела к CD45− и EpCAM+.
Лизис клеток и выделение РНК Клетки обычно лизируют химически, помещая их в . Лизирующие буферы могут различаться по качеству сохранения содержимого клетки и эффективности дальнейших процедур, проводимых с лизатом. Оптимальные протоколы лизиса одиночных клеток эукариот и прокариот также различны, так как требуется разрушить массивную и часто покрытую защитными оболочками клеточную стенку прокариот, при этом не повредив выделяемый материал.
Выделение РНК при подготовке образцов происходит не отдельным техническим этапом, а получается за счёт использования специальных праймеров для инициации обратной транскрипции.
Получение кДНК После выделения РНК необходимо получить из неё комплементарную ДНК (кДНК) с помощью обратной транскрипции. Первая цепь кДНК синтезируется при помощи специально спроектированной версии обратной транскриптазы вируса лейкемии мышей M-MuLV. Для инициации синтеза используются праймеры, имеющие в своей последовательности баркоды, иногда и последовательности, позволяющие отобрать интересующую нас фракцию РНК. Обычно нужно избавиться от рРНК и тРНК, которые составляют до 95 % выделенной тотальной РНК клетки. Этого можно достичь, используя праймеры с поли(dT)-участком, что позволяет выделить полиаденилированную фракцию. Однако при этом теряется неполиаденилированная РНК (длинные некодирующие РНК и другие), поэтому в ряде протоколов, например, SUPeR-seq, в последовательности праймеров после поли(dT)-участка добавляется несколько (5—6) случайных нуклеотидов.
Синтез второй цепи кДНК осуществляется различными способами. Часто используется (), например, в технологиях STRT, Smart-seq и Smart-seq2. Он основан на свойстве ревертазы M-MuLV добавлять на 3’-конец синтезируемой цепи нематричные остатки цитозина. Соответственно, это делает возможным синтез второй цепи с поли(dG)-праймеров.
Баркоды и уникальные молекулярные идентификаторы Технология высокопроизводительного секвенирования предполагает совместное секвенирование , полученных из разных клеток. Поэтому для различения транскриптов, пришедших из каждой конкретной клетки, используются уникальные клеточные баркоды . В экспериментах по дифференциальной экспрессии помимо баркодов используются так называемые уникальные молекулярные идентификаторы (). UMI представляет собой последовательность из 4—8 случайных нуклеотидов (например, 5 нуклеотидов дают 45=1024 уникальные последовательности). Сочетание UMI и клеточного баркода статистически получается уникальным для каждого транскрипта, что позволяет сравнивать уровни экспрессии генов по количеству UMI, «пришитых» к транскриптам определённого типа. Баркоды и уникальные молекулярные идентификаторы вносятся в образец на этапе обратной транскрипции, так как составляют часть праймера для синтеза первой цепи кДНК.
Амплификация кДНК В ряд технологий, таких как MARS-seq, CEL-seq и CEL-seq2, для амплификации кДНК используется in vitro транскрипция (). Это способ основан на транскрипции кДНК фаговой и повторении этапа обратной транскрипции. Для осуществления in vitro транскрипции в поли(dT)-праймер вносится промотор Т7. Увеличение количества кДНК в данном случае происходит линейно.
Амплификация кДНК может также осуществляться с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), например, в Drop-seq, SCRB-seq, SMART-seq и SMART-seq2. Однако этот метод часто вносит искажения в отношение количества транскриптов. С этими искажениями позволяет бороться использование уникальных молекулярных идентификаторов.
Для работы с прокариотическими клетками используются также специальные методы, такие как амплификация по типу катящегося кольца.
Подготовка геномной библиотеки и секвенирование В зависимости от способа подготовки библиотеки происходит секвенирование полноразмерных транскриптов, или фракции, обогащённой 3’- или 5’-фрагментами. Обогащение полноразмерными транскриптами (технологии SMART-seq, SMART-seq2) требуется при изучении альтернативного сплайсинга и однонуклеотидных полиморфизмов, тогда как секвенирование 3’-фрагментов (технологии CEL- seq, CEL-seq2, MARS-seq) и 5’-фрагментов (технология STRT) подходят для выявления дифференциальной экспрессии. Эти методы, как правило, используют уникальные молекулярные идентификаторы. Подготовленные библиотеки обрабатывают методами секвенирования нового поколения (англ. next generation sequencing, NGS), часто используется секвенирование на платформе Illumina. Полученные «сырые» прочтения обрабатывают методами биоинформатики.
Анализ данных
Первоочередной задачей при биоинформатическом анализе результатов секвенирования РНК одиночных клеток является получение матрицы экспрессий генов из прочтений секвенатора. После получения такой матрицы имеют место несколько направлений анализа:
Анализ на клеточном уровне: кластеризация, классификация и определение клеточных траекторий; Анализ на уровне генов: определение дифференциально экспрессирующихся генов, регуляторных сетей.
Получение матрицы экспрессии генов Стандартный протокол обработки прочтений, получаемых при секвенировании, включает в себя несколько шагов (в скобках приведены программы, использующиеся на каждом этапе):
Контроль качества прочтений (FastQC, Kraken); Картирование прочтений на (TopHat2, HISAT и другие); Подсчёт количества транскриптов исследуемых генов для каждой из клеток (используя характеристики покрытия или число уникальных молекулярных идентификаторов); При необходимости (например, если два набора данных были получены в разных местах и разными учёными) — поправка систематической ошибки (kBET); В случае, если использовался протокол без уникальных молекулярных идентификаторов, необходима нормализация матрицы (SCnorm, SAMstrt); Восстановление пропущенных данных () (MAGIC, Autoimpute).
Контроль качества прочтений При картировании обеспечивается контроль качества прочтения транскриптома каждой клетки, клетки с низким качеством прочтения исключаются из дальнейшего анализа. Для контроля качества могут использоваться разные метрики: количество прочтений на клетку; количество найденных генов;