5′-Нетранслируемая область (5′-НТО, произносится как пять-штрих-нетранслируемая область, ), или лидерная последовательность — некодирующий участок мРНК, располагающийся сразу после кэпа, но перед кодирующей областью. Такое же название имеет участок ДНК, соответствующий 5′-НТО транскрипта. В 5′-НТО располагаются различные элементы, принимающие участие в регуляции эффективности трансляции.
Структура
Длина и нуклеотидный состав Общая длина 5′-НТО, чаще всего, приблизительно одинакова для всех таксономических групп эукариот и составляет около 100 - 200 нуклеотидов, но может достигать и нескольких тысяч. Так, у дрожжей Schizosaccharomyces pombe длина 5′-НТО в транскрипте ste11 составляет 2273 нуклеотидаЗдесь и далее в разделах «Структура» и «Функции» приводится информация по эукариотическим клеточным 5′-UTR. Данные по 5′-UTR бактерий, архей и вирусов рассматриваются в соответствующем разделе.. Средняя длина 5′-НТО у человека — около 210 нуклеотидов (в то же время средняя длина 3′-НТО — 800 нуклеотидов). Наиболее длинная известная человеческая 5′-НТО — у онкогена Tre, её длина составляет 2858 нуклеотида, а длина наиболее короткой человеческой 5′-НТО составляет 18 нуклеотидов.
Состав оснований также различается в 3′- и 5′-НТО. Так, в 5′-НТО выше содержание G+C, чем в 3′-НТО. Особенно это различие заметно в мРНК теплокровных позвоночных, у которых содержание G+C в 5′-НТО составляет 60 %, а в 3′-НТО — 45 %.
Интроны Внутри участков ДНК, соответствующих 5′-НТО транскрипта, имеются интроны, как и в участках ДНК, соответствующих кодирующей области мРНК. Около 30 % генов Metazoa имеют участки, соответствующие 5′-НТО, состоящие только из экзонов. У человека же около 35 % генов имеют интроны в 5′-НТО. Интроны в 5′-НТО отличаются от таковых в кодирующей области и в 3′-НТО по нуклеотидному составу, длине и плотности. Известно, что отношение общей длины интронов к длине экзонов в 5′-НТО меньше, чем в кодирующей области, однако плотность интронов в 5′-НТО выше (по другим данным, наоборот, ниже), при этом интроны в 5′-НТО приблизительно в два раза длиннее интронов в кодирующей области. В 3′-НТО интроны встречаются значительно реже, чем в 5′-НТО.
Эволюция и функции интронов в 5′-НТО остаются в значительной мере неизученными. Тем не менее, установлено, что у активно экспрессируемых генов чаще всего бывают короткие интроны в 5′-НТО, чем длинные или они отсутствуют вовсе. Хотя связи между длиной и количеством интронов и тканью к настоящему моменту не установлено, обнаружена некоторая корреляция между числом интронов в генах и их функциями. Так, особенно много интронов было выявлено в генах, выполняющих регуляторные функции. Вообще, наличие хотя бы одного интрона в 5′-НТО усиливает экспрессию гена, усиливая транскрипцию (в данном случае идёт речь об участке ДНК, соответствующем 5′-НТО транскрипта) или стабилизируя зрелую мРНК. Например, экспрессия гена убиквитина С (UbC) зависит от наличия интрона в 5′-НТО. При утрате интрона активность промотора резко падает, и дальнейшие исследования показали, что в области 5′-НТО ДНК связываются транскрипционные факторы Sp1 и Sp3.
Вторичная структура Структурный и нуклеотидный состав 5′-НТО имеет важное значение для регуляции экспрессии генов; более того, были показаны различия в структуре 5′-НТО мРНК генов «домашнего хозяйства» и генов, задействованных в регуляции онтогенеза. 5′-НТО генов, экспрессия которых сопровождается образованием большого количества белка, как правило, имеют небольшую длину, для них характерно низкое содержание G+C, отсутствие выраженных элементов вторичной структуры и внутренних кодонов AUG (старт-кодонов), расположенных до основного старт-кодона. Напротив, 5′-НТО генов, дающих начало небольшому количеству белка, имеют большую длину, более высокое содержание GC и обладают большим числом характерных элементов вторичной структуры. Высокоструктурированные 5′-НТО нередко присущи мРНК генов, участвующих в регуляции развития; более того, эти образование этих мРНК часто характеризуется тканевой и возрастной специфичностью.
Установлено, что в 5′-НТО, оказывающих подавляющее действие на трансляцию, имеются компактные структуры вокруг старт-кодона. Хотя конкретные механизмы такой репрессии неизвестны, считается, что нуклеотидные и структурные особенности 5′-НТО обусловливают связывание с ней различных белковых факторов, активирующих или подавляющих трансляцию.
Важными и хорошо изученными элементами вторичной структуры 5′-НТО являются G-квадруплексы. Они образуются тогда, когда последовательности, обогащённые гуанином, сворачиваются в чрезвычайно стабильную неканоническую структуру из четырёх цепей; такие структуры оказывают строго подавляющее действие на трансляцию. Биоинформатический анализ позволил установить, что G-квадруплексы нередко высококонсервативны и имеются в приблизительно 3000 мРНК человека. Примерами таких мРНК человека могут служить мРНК рецептора эстрогена, внеклеточной , NRAS-протоонкогена. Помимо 5′-НТО, G-квадруплексы обнаружены в промоторах, теломерах и 3′-НТО. Особенно много G-квадруплексов в мРНК белков, участвующих в регуляции трансляции и онтогенеза. Подавляющее действие G-квадруплексов на трансляцию той мРНК, на которой они находятся, может быть обусловлено как их вторичной структурой самой по себе, так и их взаимодействием с белками и другими факторами.
Сканирующая модель инициации трансляции предполагает, что малая субъединица рибосомы движется по мРНК («сканирует») в направлении от 5′- к 3′-концу в поисках подходящего старт-кодона AUG и с него начинает трансляцию. При этом также считалось, что наличие стабильных элементов вторичной структуры (например, шпилек) в 5′-НТО оказывает подавляющее действие на трансляцию, поскольку через них рибосома пройти неспособна. Однако недавние исследования показали, что так происходит далеко не всегда. Трансляция мРНК с длинной, высокоструктурированной 5′-НТО может идти не хуже, чем мРНК с короткой и неструктурированной 5′-НТО. Объясняется это тем, что подавляющий эффект самой по себе вторичной структуры часто не выражен, поскольку он определяется прежде всего взаимодействующими с ней белками. Господствовавшая ранее вышеописанная ошибочная точка зрения появилась из-за того, что ранее исследователи использовали систему лизата ретикулоцитов кролика ()), и эта система имела ряд недостатков и не соответствовала условиям in vivo.
Альтернативные 5′-НТО Существует несколько механизмов образования альтернативных 5′-НТО при одной и той же кодирующей последовательности: использование альтернативных промоторов; образование различных 5′-НТО в ходе альтернативного сплайсинга; использование альтернативных сайтов начала транскрипции в пределах одного промотора.
Наличие различных 5′-НТО в мРНК одного и того же гена даёт дополнительные возможности для регуляции его экспрессии, поскольку даже небольшие различия во вторичной структуре 5′-НТО могут коренным образом повлиять на регуляцию трансляции. Анализ транскриптомов млекопитающих показал, что экспрессия альтернативных 5′-НТО есть распространённый феномен и потенциально большая часть генов может использовать такой механизм регуляции. Белковые продукты генов, постоянно использующих альтернативные 5′-НТО, обычно задействованы в таких процессах, как транскрипция и сигнальные пути. Например, ген рецептора эстрогена β (ERβ) имеет 3 мРНК с альтернативными 5′-НТО, дающими начало изоформам одного и того же белка, и зачастую сбои в их активности наблюдаются при раковых заболеваниях.
Функции Внутри 5′-НТО локализуются важные функциональные элементы, участвующие в инициации трансляции и контроле экспрессии генов. Об этом свидетельствует, во-первых, то, что скорость трансляции не зависит от длины и структуры 5′-НТО как в кэпированных, так и некэпированных мРНК, а также то, что некоторые гены способны экспрессироваться в условиях стресса. К важнейшим из таких функциональных элементов относят участки внутренней посадки рибосомы (IRES), внутренние открытые рамки считывания uORFs, железозависимый элемент (IRE) и др.
IRES
Участок внутренней посадки рибосомы () — это регуляторный мотив мРНК, осуществляющий кэп-независимый механизм инициации трансляции, при котором посадка рибосомы происходит внутри 5′-НТО, но рядом с сайтом начала трансляции. Механизм IRES используется как кэпированными, так и некэпированными мРНК в условиях, когда кэп-зависимая инициация трансляции подавлена по причине стресса, в определённой стадии клеточного цикла и при апоптозе, обеспечивая продолжительную экспрессию необходимых белков. Ряд генов, использующих IRES, например, гены c-Myc, APAF1, Bcl-2, при нормальных условиях экспрессируются мало и активируются за счёт IRES в условиях стресса. Предполагается, что IRES может также принимать участие в поддержании в нормальных условиях низкого уровня экспрессии ряда белков, забирая на себя рибосомы и не давая им начать трансляцию с основного сайта инициации. Механизм внутренней инициации трансляции пока плохо понятен, хотя точно известно, что эффективность IRES в значительной мере находится под влиянием транс'′-регуляторных белковых факторов, что даёт возможность для клеточно-специфического использования IRES в трансляции.
Структура эукариотических IRES очень различна, и на данный момент не было установлено никаких характерных для них консервативных мотивов. Для некоторых генов для работы IRES необходимы специфичные стабильные элементы вторичной структуры мРНК, у других генов, напротив, они оказывают подавляющее действие на трансляцию. Было высказано предположение, что IRES не являются статичными структурами и подвергаются перемещениям, значительно изменяя свою активность. Элементы IRES могут также давать начало различным изоформам белков, что даёт дополнительные возможности получения различных белковых продуктов с одного и того же гена.
uORF
Короткие открытые рамки считывания () располагаются в 5′-НТО и характеризуются тем, что их внутрирамковый стоп-кодон располагается после внутреннего старт-кодона (), но перед основным старт-кодоном, который находится уже в транслируемой (кодирующей) области. uORF обнаружены в приблизительно 50 % 5′-НТО человеческих мРНК, и их наличие обусловливает снижение экспрессии генов, уменьшая количество функциональной мРНК на 30 %, а образование белка — на 30—80 %. Рибосомы, связывающиеся с uAUG, начинают трансляцию uORF, что может отрицательно сказаться на эффективности трансляции основной рамки считывания (то есть кодирующей области). Если не происходит эффективного связывания рибосомы со старт-кодоном в кодирующей области (то есть инициации трансляции), то в результате снижается образование белка, а значит, и уровень экспрессии соответствующего гена. Может произойти и обратная ситуация: трансляция uORF продолжится в трансляцию кодирующей области, и в итоге образуется слишком длинный белок, который может быть вредоносным для организма. Снижение эффективности трансляции из-за наличия uORF в 5′-НТО является хорошо изученным эффектом; одним из примеров, иллюстрирующих его, может служить ген (), чья мРНК содержит две высококонсервативные uORF в 5′-НТО. Мутация проксимального uAUG вызывает повышение эффективности трансляции этой мРНК, что свидетельствует о том, что uORF значительно снижает экспрессию этого гена. Другим примером является рецептор тироидного гормона, оказывающий активирующее или репрессирующее действие на транскрипцию ряда генов-мишеней; сильная репрессия его трансляции осуществляется uORF длиной 15 нуклеотидов внутри 5′-НТО его мРНК.