Nikotínamidadeníndinukleotid (NAD) je ústredný kofaktor v metabolizme. Nachádza sa vo všetkých bunkách. NAD je dinukleotid, pretože obsahuje dva nukleotidy spojené fosfátovými skupinami. Jeden nukleotid obsahuje bázu adenín a druhý obsahuje nikotínamid. NAD existuje v dvoch podobách: ako oxidovaná a redukovaná forma, skrátene NAD+ a NADH (H ako vodík). V podobe NAD+ poukazuje „+“ na formálny náboj jedného z dusíkových atómov, ale molekula samotná je v skutočnosti jednomocný anión – s jednotkovým záporným nábojom – pri fyziologickom pH. Naopak NADH je dvojvalentný anión, kvôli dvom mostíkovým fosfátovým skupinám.
V metabolizme je nikotínamidadeníndinukleotid súčasťou redoxných reakcií a prenáša elektróny z jednej reakcie do druhej. Ako kofaktor sa teda v bunkách nachádza v dvoch formách: NAD+ je oxidačné činidlo – prijíma elektróny od iných molekúl, čím sa redukuje. V tejto reakcii sa tvorí NADH, ktorý potom vystupuje ako redukčné činidlo a odovzdáva elektróny. Tieto reakcie, pri ktorých sa presúvajú elektróny, sú hlavnou funkciou NAD. NAD však vystupuje i v iných bunkových procesoch predovšetkým ako substrát enzýmov, ktoré pridávajú alebo odštepujú funkčné skupiny na alebo z bielkovín v posttranslačných úpravách. Kvôli dôležitosti týchto reakcii sú enzýmy vystupujúce v metabolizme NAD cieľom pre nové liečivá.
V organizmoch je možné syntetizovať NAD z jednoduchých základných molekúl (de novo), a to z aminokyselín tryptofánu alebo aspartátu. Alternatívne sú zložitejšie časti koenzýmov prijímané z potravy, napríklad v podobe niacínu. Podobné molekuly sú takisto produkované reakciami, ktoré rozkladajú štruktúru NAD, takže je z nich možné recyklovať a znovu získať aktívnu formu NAD.
NAD sa sčasti konvertuje na koenzým nikotínamidadeníndinukleotidfosfát (NADP). Chemické reakcie NADP sú veľmi podobné NAD, ale NADP vystupuje hlavne ako kofaktor v anabolickom metabolizme.
Fyzikálne a chemické vlastnosti Nikotínamidadeníndinukleotid pozostáva z dvoch nukleozidov spojených mostíkovými fosfátovými skupinami. Každý nukleozid obsahuje ribózový kruh, jeden s adenínom naviazaným na prvý uhlík (pozíciu 1') cukru (adenozíndifosfátribóza) a druhý s nikotínamidom na danej pozícii. Nikotínamidová skupina môže byť na tento anomérny uhlík pripojená v dvoch rôznych orientáciách. Kvôli týmto dvom možným štruktúram existuje NAD ako dva diastereoméry. V organizmoch sa nachádza β-nikotínamidový diastereomér NAD+. Tieto nukleotidy sú spojené fosfátovými skupinami na uhlíku 5'. náhľad|250x250bod|Redoxná reakcia nikotínamidadeníndinukleotidu. V metabolizme táto zlúčenina prijíma a odovzdáva elektróny v redoxných reakciách. Tieto reakcie spočívajú v odobraní dvoch vodíkových atómov z reaktantu (R) v podobe hydridového aniónu (H-) a protónu (H+). Protón sa rozpustí v roztoku, zatiaľ čo reduktant RH2 sa oxiduje a NAD+ sa redukuje na NADH presunom hydridu na nikotínamidový kruh:
RH2 + NAD+ → NADH + H+ + R
Z elektrónového páru hydridu je jeden elektrón presunutý na kladne nabitý dusík nikotínamidového kruhu NAD+ a druhý vo vodíkovom atóme je presunutý na C4 uhlík oproti dusíku. Elektrodový potenciál redoxného páru NAD+/NADH je -0,32 V, čo z NADH robí silné redukčné činidlo. Táto reakcia je jednoducho reverzibilná, keď NADH redukuje inú molekulu a znovu sa oxiduje na NAD+. Vďaka tomu môže koenzým opakovane prechádzať medzi formami NAD+ a NADH bez spotrebovania.
Všetky podoby tohto koenzýmu sú biele amorfné prášky, ktoré sú hygroskopické a veľmi dobre rozpustné vo vode. Ako pevné látky sú stabilné, ak sú uchovávané v suchu a v tme. Roztoky NAD+ sú bezfarebné a stabilné asi 1 týždeň pri 4 °C a neutrálnom pH, ale rýchlo sa rozkladajú v kyselinách alebo zásadách. Po rozklade tvoria produkty, ktoré inhibujú enzýmy. vpravo|náhľad|250x250bod|UV absorpčné spektrum NAD+ a NADH. NAD+ i NADH silne absorbujú ultrafialové žiarenie kvôli prítomnosti adenínu. Ako príklad, maximum absorpcie NAD+ je pri vlnovej dĺžke 259 nanometrov (nm) s absorpčným koeficientom 16,900 M−1 cm−1. NADH absorbuje aj pri vyšších vlnových dĺžkach s druhým maximom v UV oblasti pri 339 nm a s absorpčným koeficientom 6,220 M−1 cm−1. Tento rozdiel v absorpčných spektrách medzi oxidovanou a redukovanou formou koenzýmu pri vyšších vlnových dĺžkach umožňuje jednoduché meranie premeny jednej formy na druhú pri stanoveniach enzýmov – meraním množstva absorbovaného UV žiarenia pri 340 nm pomocou spektrofotometra možno stanoviť zmenu koncentrácie NADH v roztoku počas reakcie.
NAD+ a NADH sa líšia aj vo svojej fluorescencii. NADH v roztoku má maximum v emisnom spektre pri 340 nm a polčas fluorescencie 0,4 nanosekundy, zatiaľ čo oxidovaná forma koenzýmu nefluoreskuje. Vlastnosti fluorescenčného signálu sa menia pri naviazaní NADH na bielkoviny, takže tieto zmeny je možné využiť na stanovenie disociačných konštánt, ktoré sú užitočné v enzýmovej kinetike. Tieto zmeny vo fluorescencii je možné využiť na stanovenie zmien redoxných stavov v živých bunkách pomocou fluorescenčnej mikroskopie.
Koncentrácia a stav v bunkách V pečeni potkanov je celková koncentrácia NAD+ a NADH asi 1 μmol/g hmotnosti (vrátane vody), asi desaťnásobok koncentrácie NADP+ a NADPH v tých istých bunkách. Skutočnú koncentráciu NAD+ v bunkovom cytosóle je zložitejšie zmerať, nedávne odhady v zvieracích bunkách sú približne 0,3 mM a približne 1,0 až 2,0 mM v kvasinkách. Až 80 % fluorescencie NADH v mitochodnriách je však vo viazanej podobe, takže jeho koncentrácia v roztoku je omnoho nižšia.
Koncentrácia NAD+ je najvyššia v mitochondriách a tvorí 40 – 70 % celkového bunkového NAD+. NAD+ v cytosóle je presunutý do mitochondrie špecifickým membránovým transportným proteínom, keďže tento koenzým nemôže difundovať skrz membrány. Vnútrobunkový polčas života NAD+ je podľa jednej review odhadovaný na 1-2 hodiny, zatiaľ čo iná review dáva rôzne odhady podľa rôznych kompartmentov (oddelených častí buniek): vnútrobunkový polčas 1-4 hodiny, cytoplazmový 2 hodiny a mitochondriový 4-6 hodín.
Rovnováha medzi oxidovanou a redukovanou formou nikotínamidadeníndinukleotidu sa nazýva pomer NAD+/NADH. Tento pomer je dôležitou súčasťou redoxného stavu bunky, miery poukazujúcej na metabolické aktivity a zdravie buniek. Následky pomeru NAD+/NADH sú komplexné, riadia aktivitu niekoľkých kľúčových enzýmov, zahŕňajúc glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu a pyruvátdehydrogenázu. V zdravom cicavčom tkanive je pomer voľného NAD+ a NADH v cytoplazme typicky odhadovaný okolo 700:1, pomer je teda výrazne v prospech oxidačných reakcií. Pomer celkového NAD+/NADH je omnoho nižší, s odhadmi u cicavcov okolo 3-10. Naproti tomu pomer NADP+/NADPH je bežne okolo 0,005, takže prevažuje podoba NADPH. Tento rozdiel pomerov je kľúčový pre rôzne metabolické úlohy NADH a NADPH.
Biosyntéza NAD+ je syntetizovaný dvomi metabolickými dráhami. Produkuje sa buď v de novo dráhe z aminokyselín alebo recyklačnej dráhe pomocou recyklácie komponent ako je nikotínamid naspäť na NAD+. Aj keď väčšina tkaniva u cicavcov syntetizuje NAD+ pomocou recyklačnej dráhy, de novo syntéza prebieha vo väčšej miere v pečeni z tryptofánu a v obličkách a makrofágoch z kyseliny nikotínovej.
Produkcia de novo vpravo|náhľad|350x350bod|Niektoré metabolické dráhy, ktorými prebieha syntéza a spotreba NAD+ u stavovcov. Skratky sú vysvetlené v texte. Väčšina organizmov syntetizuje NAD+ z jednoduchých zložiek. Konkrétny súbor reakcií sa medzi organizmami líši, ale spoločným znakom je tvorba kyseliny chinolínovej (QA, z anglického quinolinic acid) z aminokyseliny – buď tryptofánu (Trp) u zvierat a niektorých baktérií, alebo aspartátu (Asp) u niektorých baktérií a rastlín. Kyselina chinolínová sa mení na mononukleotid kyseliny nikotínovej (NaMN, z anglického nicotinic acid mononucleotide) pomocou transferu fosforibózového zvyšku. Následne je naňho pripojený adenylát za tvorby kyselina nikotínová adeníndinukleotidu (NaAD). Nakoniec sa kyseliny nikotínová amiduje na nikotínamid, čím vzniká nikotínamidadeníndinukleotid (NAD).
V ďalšom kroku sa časť NAD+ konvertuje na NADP+ pomocou enzýmu NAD+ kináza, ktorý fosforyluje NAD+. U väčšiny organizmov tento enzým využíva ATP ako zdroj fosfátu, ale niektoré baktérie, ako napríklad Mycobacterium tuberculosis a hypertermofilný archeón Pyrococcus horikoshii, využívajú polyfosfát ako alternatívny zdroj fosfátu.
Obnovovacie dráhy náhľad|300x300bod|Obnovovacie dráhy využívajú tri prekurzory NAD+: kyselinu nikotínovú, nikotínamid a nikotínamidribozid. Napriek prítomnosti dráhy na syntézu de novo existujú recyklačné reakcie, ktoré sú u človeka dôležité. Nedostatok niacínu v potrave spôsobuje vitamínovú deficienciu (nedostatok) zvanú pelagra. Tento vysoký nárok na NAD+ vychádza z konštantnej spotreby koenzýmu v reakciách ako sú posttranslačne úpravy, keďže cyklovanie NAD+ medzi oxidovanou a redukovanou formou v redoxných reakciách nemení celkové množstvo koenzýmu. Hlavným zdrojom NAD+ u cicavcov sú obnovovacie dráhy, ktoré recykluju nikotínamid produkovaný enzýmami využívajúcimi NAD+. V prvom kroku tejto dráhy, ktorý je zároveň rýchlosť určujúcim krokom, vystupuje enzým nikotínamidfosforibozyltransferáza (NAMPT), ktorá produkuje nikotínamidmononukleotid (NMN). NMN je priamym prekurzorom NAD+ v tejto dráhe.
Okrem skladania NAD+ de novo z jednoduchých aminokyselinových prekurzorov využívajú bunky aj zlúčeniny obsahujúce pyridínový základ. Tri vitamínové prekurzory využívané v recyklačných metabolických dráhach sú kyselina nikotínová (NA), nikotínamid (Nam) a nikotínamidribozid (NR). Tieto zlúčeniny je možné prijať priamo z potreby a sú označované ako vitamín B3 alebo niacín. Tieto zlúčeniny sú však produkované aj priamo v bunke a spotrebou bunkového NAD+. Niektoré enzýmy vystupujúce v týchto obnovovacích dráhach sa zrejme združujú u bunkového jadra, čo môže kompenzovať vysokú spotrebu NAD+ v tejto organele. Podľa niektorých poznatkov môžu bunky cicavcov prijímať extracelulárny NAD+ zo svojho okolia a rovnako môžu byť nikotínamid a nikotínamidribozid prijímané v črevách.
Obnovovacie reakcie prebiehajúce u mikroorganizmov sa líšia od cicavčích. Niektoré patogény, ako kvasinky Candida glabrata a baktéria Haemophilus influenzae, sú NAD+ auxotrofy – nevedia syntetizovať NAD+ – ale majú recyklačné dráhy a teda sú závislé na zdrojoch NAD+ alebo jeho prekurzoroch zo svojho okolia. Ešte prekvapujúcejší je vnútrobunkový patogén Chlamydia trachomatis, ktorému chýbajú rozpoznateľní kandidáti na akékoľvek gény vystupujúce v biosyntéze či obnove NAD+ i NADP+, takže musí tieto koenzýmy získavať od svojho hostiteľa.
Funkcie vpravo|náhľad|272x272bod|Rossmannov fold tvorí časť laktátdehydrogenázy mikroorganizmu Cryptosporidium parvum. NAD+ je znázornený červenou farbou, beta listy žltou a alfa helixy fialovou. Nikotínamidadeníndinukleotid má niekoľko dôležitých úloh v metabolizme. Funguje ako koenzým v redoxných reakciích, ako donor ADP-ribózy v ADP-ribozylačných reakciách, ako prekurzor druhého posla cyklickej ADP-ribózy, zároveň vystupuje ako substrát pre bakteriálne DNA ligázy a skupinu enzýmov zvaných sirtuíny, ktoré využívajú NAD+ na odstránenie acetylových skupín z bielkovín. Okrem týchto metabolických funkcií vystupuje NAD+ ako adenínový nukleotid, ktorý môže opustiť bunku spontánnymi a regulovanými mechanizmami, takže môže mať dôležité mimobunkové úlohy.
Oxidoreduktázová väzba NAD
Hlavná úloha NAD+ v metabolizme je presun elektrónov z jednej molekuly na druhú. Reakcie tohto typu sú katalyzované veľkou skupinou enzýmov zvaných oxidoreduktázy. Správne názvy týchto enzýmov obsahujú názov oboch ich substrátov: napríklad NADH-ubichinón oxidoreduktáza katalyuje oxidáciu NADH koenzýmom Q. Tieto enzýmy sú však často označované ako dehydrogenázy a reduktázy, napríklad NADH-ubichinón oxidoreduktáza sa bežne nazýva NADH dehydrogenáza alebo koenzým Q reduktáza.