Monoklonska protitelesa (mAb) so monospecifična in monoafinitetna protitelesa, usmerjena torej proti enemu antigenu in enemu epitopu. Köhler in Milstein sta leta 1975 izdelala metodo za pridobivanje monoklonskih protiteles s hibridizacijo celic. S to metodo je mogoče pridobiti specifična protitelesa po želji v neomejenih količinah. Ta metoda temelji na zlitju (fuziji) ali somatični hibridizaciji med normalnim limfocitom B, ki proizvaja protitelesa, in mielomsko celico ter selekcijo zlitih celic, ki izločajo protitelesa želene specifičnosti. Take, z zlitjem pripravljene nesmrtne linije celic, imenujemo hibridomi in protitelesa, ki jih izdelujejo, monoklonska protitelesa. Uspeh te metode je temeljil na pripravi mielomskih celičnih linij, ki se razmnožujejo v normalnem gojišču za kulturo celic, vendar se ne razmnožujejo v selekcijskem gojišču, ker nimajo potrebnih genov za sintezo DNK v tem gojišču. Normalne celice po zlitju z mielomskimi celicami prispevajo potrebne gene, tako da se v selekcijskem gojišču lahko razmnožujejo samo somatični celični hibridi, lastnosti mielomske celice pa napravijo take hibridome nesmrtne.

Nastanek in selekcija hibridnih celic Po zlitju dveh somatičnih celic nastane celica, ki ji pravimo heterokariont. Zlitje lahko dosežemo z inkubiranjem suspenzije dveh celic z inaktiviranim virusom Sendai ali pa s polietilenglikolom (PEG). Oba omogočata zlitje plazemskih membran, pri čemer nastane hibridna celica z dvema ločenima jedroma – heterokariont. Po več delitvah se jedri združita v eno veliko jedro, ki ima kromosome obeh starševskih celic. V tem stadiju je celica nestabilna, se razmnožuje in izgublja različno število kromosomov od enega ali obeh partnerjev, dokler se končno ne stabilizira. Naključna izguba kromosomov pa lahko povzroči, da se izgubijo kromosomi, ki so potrebni za preživetje celice, in tak hibridom odmre. Lahko se seveda izgubijo tudi kromosomi, ki so potrebni za sintezo protiteles. Pri postopku fuzije se dejansko zlije le majhen odstotek celic in nekatere zlite celice nastanejo iz homogenih starševskih celic A-A ali B-B in samo nekatere so želeni hibridi A-B. Hibridne celice je zato treba ločiti od homogenih zlitih celic in od nezlitih celic. Pri najbolj pogosto uporabljeni metodi za osamitev hibridov A-B vzamemo mielomske celice, ki zaradi mutacije ne zmorejo sinteze nukleotidov po eni od dveh sinteznih poti. Zlite celice gojimo nato v gojišču HAT (H = hipoksantin, A = aminopterin, T = timidin), v katerem preživijo samo hibridne celice A-B.f> Podlaga za selekcijo v gojišču HAT je ugotovitev, da sesalske celice lahko sintetizirajo nukleotide po dveh različnih sinteznih poteh: po poglavitni poti, imenovani pot de novo, in po pomožni poti. Pot de novo, po kateri se formilne ali metilne skupine prenesejo iz aktivirane oblike tetrahidrofolata, blokira aminopterin, analog folne kisline. Če je poglavitna pot blokirana, uporabi celica pomožno pot, ki obide aminopterinsko blokado. Encima, ki katalizirata sintezo po pomožni poti, sta hipoksantin-gvanozin fosforibozil transferaza (HGPRT) in timidin kinaza (TK). Gojišče HAT tako zaradi aminopterina blokira poglavitno pot, hipoksantin in timidin pa delujeta kot substrata za sintezo nukleinskih kislin po alternativni poti. Če zlijemo dve celici, eno z mutiranim genom za TK in eno z mutiranim genom za HGPRT, se bodo v gojišču HAT lahko razmnoževale le fuzirane hibridne celice, ki imajo vse potrebne encime za razmnoževanje v tem gojišču.

Priprava in čiščenje monoklonskih protiteles Za enega fuzijskega partnerja vzamemo mielomske celice, ki ne izdelujejo protiteles, so torej Ig- in so tudi HGPRT-. Te celice ne preživijo v gojišču HAT, podelijo pa zlitim celicam nesmrtnost. Drugi fuzijski partner pa so vranične celice, ki vsebujejo aktivirane limfocite B (so Ig+ in HGPRT+). Nezlite vranične celice so končno diferencirane, živijo le kratek čas, zato izven organizma kmalu odmrejo. Po fuziji razdelimo zlite celice v jamice za mikrokulturo, kjer je gojišče HAT. Po 7–10 dneh so v večini jamic celice mrtve, v nekaterih pa so vendarle majhne gruče živih celic, ki jih lahko odkrijemo z obrnjenim (invertnim) faznokontrastnim mikroskopom. Vsaka gruča predstavlja klonsko ekspanzijo enega hibridoma. Posamezne celice iz teh gruč prenesemo in jih gojimo v ločenih jamicah, da si zagotovimo monoklonskost za vsako izločeno protitelo. Klone iz posameznih celic testiramo glede na navzočnost protiteles v supernatantni tekočini. Klone, ki proizvajajo želena protitelesa, lahko naprej subkloniramo, da si zanesljivo zagotovimo čistost klona v vsaki vdolbinici za mikrokulturo.

Ko dobimo čiste klone hibridomov, ki proizvajajo protitelesa, jih testiramo glede na želeno specifičnost protiteles. Najbolj uporabljeni tehniki sta encimskoimunski test (ELISA) in radioimunski test (RIA). Po določitvi hibridoma, ki izloča želeno protitelesno specifičnost, ta hibridom znova kloniramo z metodo končnega razredčenja, da si zagotovimo, da je kultura v resnici monoklonska. Klonirane hibridome nato razmnožujemo na različne načine in pridobivamo velike količine monoklonskih protiteles. Hibridome lahko gojimo v steklenicah za tkivno kulturo ali pa v peritonealni votlini histokompatibilnih (singenskih) miši, kjer se protitelesa izločajo v ascites v velikih koncentracijah, vendar se zaradi etičnih razlogov ta način proizvodnje protiteles vse bolj opušča.

Tako v tkivni kulturi kot v ascitesu je poleg želenih monoklonskih protiteles še mnogo drugih molekul, ki jih moramo za nadaljnjo uporabo protiteles odstraniti. V tkivni kulturi so neželene komponente, predvsem rastni faktorji, hormoni in transferini, medtem ko vzorec in vivo vsebuje poleg monoklonskih protiteles še druga protitelesa, proteaze, nukleaze, nukleinske kisline in viruse. V obeh primerih so lahko hibridomi v vzorec izločili tudi citokine, prav tako pa so vzorci lahko kontaminirani z bakterijami in njihovimi izločki (endotoksini).

Vzorec z monoklonskimi protitelesi najprej pripravijo za čiščenje tako, da celice in njene dele, lipide in še druge možne večje nečistoče odstranijo s centrifugiranjem, ki ji sledi filtracija s porami filtra 0,45 µm. V primeru nezadostnih koncentracij monoklonskih protiteles te skoncentrirajo z ultrafiltracijo ali z dializo.

Večino nabitih nečistoč predstavljajo anioni, kot so nukleinske kisline in endotoksini. Teh se znebimo z ionsko-izmenjevalno kromatografijo.lasek J, Ionescu R (2008). "Hetergeneity of Monoclonal Antibodies Revealed by Charge-Sensitive Methods". Current Pharmaceutical Biotechnology 9 (6): 468–481. Pri kation-izmenjevalni kromatografiji pri dovolj nizki vrednosti pH se želena protitelesa vežejo na kolono, medtem ko anioni potujejo skozi, pri anion-izmenjevalni kromatografiji pri dovolj visoki vrednosti pH pa želena protitelesa potujejo skozi kolono, medtem ko se anioni vežejo.

Beljakovine lahko ločujemo glede na njihovo izoelektrično točko (pI). Primer: albumin ima izoelektrično točko pri 4,8, kar je precej manj od izoelektrične točke večine monoklonskih protiteles, ki imajo pI okoli 6,1. Po drugi strani pa s to metodo ne moremo dobro ločiti monoklonskih protiteles od transferinov, ki imajo izoelektrično točko pri 5,9. Za dobro ločitev namreč velja, da mora biti razlika v pI vsaj za 1. Transferin tako od vzorca raje ločujemo z gelsko kromatografijo. Mnogo hitrejša, enostopenjska metoda za čiščenje pa je afinitetna kromatografija z uporabo proteina A/G ali specifičnega antigena. Protitelesa lahko ločimo od drugih beljakovin tudi z obarjanjem, pri tem uporabljamo natrijev sulfat ali amonijev sulfat. Protitelesa se namreč oborijo že pri nizkih koncentracijah soli, medtem ko večina drugih beljakovin šele pri višjih koncentracijah.

Doseženo čistost vzorca lahko analiziramo s kromatogramom. Kakršnakoli nečistoča bo dala vrh, površina pod vrhom pa nakazuje na količino te nečistoče. Alternativno lahko izvedemo tudi gelsko elektroforezo in kapilarno elektroforezo, pri čemer za vsako nečistočo tudi tukaj dobimo lise različnih intenzitet, odvisno od množine nečistoče.

Človeška monoklonska protitelesa Priprava človeških monoklonskih protiteles je precej težavna. Največjo težavo predstavlja izolacija aktiviranih limfocitov B. Človeške hibridome je namreč treba pripraviti iz človeške periferne krvi, ki pa ima zelo malo aktiviranih limfocitov B. Ljudi seveda ne moremo imunizirati, kot lahko to storimo pri miših. To težavo so poskušali rešiti z imunizacijo humanih celic in vitro, vendar je odziv drugačen kot in vivo, posledica tega je, da celice B navadno izdelujejo samo šibko afinitetna protitelesa IgM. Imunizaciji humanih celic in vitro se lahko izognemo z vgraditvijo genov, ki zapisujejo humana protitelesa, v t. i. SCID-humano miš. Mutiranemu sevu miši, ki so brez limfocitov B, so vgradili humani priželjc in bezgavke. SCID-humana miš ima tako humane limfocite B in T. Po imunizaciji teh miši lahko iz vranice osamimo aktivirane limfocite B in jih uporabimo za pripravo humanih monoklonskih protiteles. Druga velika težava pri pripravljanju humanih monoklonskih protiteles je pomanjkanje humanih mielomskih celic, ki bi bile nesmrtne, primerne za selekcijo v gojišču HAT in ki ne izdelujejo protiteles. Način, da se naredi humane celice nesmrtne, je tak, da normalne limfocite B transformirajo z virusom Epstein-Barr. Če limfocite B kultiviramo skupaj z antigenom v navzočnosti tega virusa, se nekateri limfociti B transformirajo in pridobijo lastnost trajnega razmnoževanja in izdelovanja protiteles. Kloniranje takih spremenjenih in aktiviranih celic lahko uporabimo za pripravo človeških monoklonskih protiteles

Imunotoksini Imunotoksini, ki so sestavljeni iz monoklonskih protiteles, specifičnih za tumor, na katerih je pritrjen toksin, so potencialne zdravilne učinkovine. Toksini, ki jih uporabljamo za pripravljanje imunotoksinov, so ricin, toksin šiga in davični toksin. Primerni so še številni drugi. Vsi ti preprečujejo sintezo beljakovin. Vsak tak toksin je sestavljen iz dveh funkcijsko različnih polipeptidov: toksinske verige in verige, ki se pritrdi na celični površinski receptor. Brez pritrjevalnega polipeptida je toksin neškodljiv, ker ne more v celico. Imunotoksine pripravimo tako, da nadomestimo pritrjevalni polipeptid z monoklonskim protitelesom, specifičnim za določen tumorski antigen. Pritrjeno protitelo teoretično usmeri toksin specifično na tumorsko celico in jo ubije s tem, da prepreči sintezo beljakovin. Klinično preizkušajo več imunotoksinov. Spodbudne rezultate so dosegli pri levkemijah in limfomih, medtem ko so bili rezultati pri bolnikih z velikimi tumorji do zdaj neuspešni.

Z genskim inženiringom preoblikovana monoklonska protitelesa Če vbrizgnemo mišja monoklonska protitelesa ljudem, jih ti spoznajo za tuje in razvijejo proti njim protitelesni odziv. Nastala človeška protitelesa proti mišjim protitelesom hitro zmanjšajo učinkovitost mišjih monoklonskih protiteles in jih odstranijo iz telesa. Poleg tega pa lahko krožeči kompleksi mišjih in človeških protiteles povzročijo alergične reakcije. Te nezaželene reakcije močno omejujejo uporabo mišjih monoklonskih protiteles pri ljudeh. En način, da se izognemo vsaj nekaterim od teh zapletov, je razumljivo uporaba človeških monoklonskih protiteles. Zaradi tehničnih težav pri pripravi le-teh in zaradi zapletov, ki jih povzroča uporaba mišjih monoklonskih protiteles pri ljudeh, skušajo raziskovalci preoblikovati monoklonska protitelesa z rekombinantno tehnologijo DNK.

Himerna monoklonska protitelesa