мини|350п|Протеин је у ствари ланац аминокиселинских секвенци. Протеини су молекули аминокиселина повезани пептидном везом и то одређеним редоследом који се назива аминокиселинска секвенца. Под примарном структуром протеина подразумева се, осим његове аминокиселинске секвенце, и број полипептидних низова из којих се молекул датог протеина састоји, као и број и положај дисулфидних мостова у њему.Весна Никетић: Принцип структуре и активности протеина, Хемијски факултет-Универзитет у Београду,1995.

После биосинтезе протеини подлежу процесима пост-транслационих модификација у којим долази до ковалентног везивања појединих компоненти за бочне остатке аминокиселина. У примарној структури протеина садржано је обиље информација на основу којих су формирани модерни концепти у биохемији. Одређивање примарне структуре протеина један је од типичних послова којима се биохемичари баве.

Пептидна веза α-аминокиселине могу да граде амидну везу између α-амино-групе једне и α-карбоксилне групе друге аминокиселине уз елиминацију молекула воде:

Настала амидна -{CO-NH}- веза назива се пептидна веза. При биосинтези протеина настанак једне пептидне везе повезан је са хидролизом четири анхидридне везе у молекулу АТП-а и ГТП-а са укупном променом слободне енергије од око 60 -{kJ/mol}-. За синтезу пептидне везе је потребно око 20 -{kJ/mol}-, остатак се троши у процесу транслације РНК у полипептид.

Енергија активације за реакцију хидролизе је висока, тако да до хидролизе пептидне везе у воденом раствору долази тек у присуству катализатора (киселине, базе, протеолитички ензими) који снижавајући енергију активације, знатно повећавају брзину ове реакције. У одсуству катализатора пептидна веза ће бити врло стабилна и под физиолошким условима и у експерименталном раду са протеинима.

Дисулфидна веза Дисулфидна веза настаје оксидацијом остатака цистеина у цистин.

Да би -{С-С}- веза настала два дела пептидног низа треба да се приближе и то под одређеним углом. Дисулфидни мост -{-С-С-}- настаје између два полипептидна низа (као код инсулина) или између делова истог полипептидног низа (као код инсулина и рибонуклеазе). Дати остатак цистеина комбинује се само са једним одређеним остатком цистеина у полипептидном низу, тако да су комбинације дисулфидних мостова у једном протеину јединствене. Настајање дисулфида није генетички детерминисано. Дисулфидни мостови настају после процеса биосинтезе протеина.

Дисулфидна веза стабилизује структуру протеина и јавља се код протеина који се налазе у екстрацелуларном простору. Типични примери су змијски отров, пептидни хормони, ензими дигестивног тракта, имуноглобулини, лизозим, протеини млека. Протеини који се налазе у ћелији и никада је не напуштају ретко садрже дисулфидне мостове. Већина протеина садржи или цистеин или цистин, врло ретко обе аминокиселине.

Номенклатура

Аминокиселина уграђена у пептидни ланац назива се (због елиминације воде из молекула аминокиселине при грађењу пептидне везе) аминокиселински остатак, а обележава се тако што се на крају назива аминокиселине суфикс -ин замени са -ил.

Према -{IUPAC-IUB}- конвенцији протеин је полипептидни низ који садржи више од 50 аминокиселинских остатака, док се полипептидни низ који садржи 50 и мање аминокиселинских остатака назива пептид. Назив пептида формира се додатком префикса за број аминокиселинских остатака у њему (ди-, три-, тетра-, пента- итд пептид). Олигопептиди садрже неколико аминокиселинских остатака. Полипептиди који се састоје из идентичних аминокиселинских остатака су хомополипептиди, а они који се састоје из различитих остатака хетерополипептиди.

Редослед аминокиселина у полипептидном низу се пише од краја на коме се налази слободна α-амино-група (-{N}--терминал). Крај полипептидног низа на коме се налази -{COOH}- група назива се -{C}--терминал. Уобичајено је да се аминокиселинска секвенца приказује помоћу скраћеница за називе аминокиселина.

Одређивање примарне структуре протеина Одређивање секвенце аминокиселина састоји се из: раздвајања полипептидних ланаца кидања дисулфидних мостова утврђивања аминокиселинског састава сваког полипептидног ланца идентификације -{N-}- и -{C-}-терминалних крајева фрагментирања полипептидног ланца и одређивања аминокиселинског састава сваког фрагмента понављања корака 5 коришћењем друге процедуре за сечење полипептидног ланца. Овим поступком се добија преклопљена аминокиселинска секвенца. Реконструкције аминокиселинске секвенце целог полипептида Одређивање позиције дисулфидних мостова између два цистеина

Раздвајање полипептидних ланаца Дисоцијација протеина на полипептидне ланце се врши екстремном променом -{pH}-, додавањем 8М урее, 6М гаунидијум-хидрохлорида или високих концентрација соли. При томе долази до нарушавања водоничне везе у протеину и између протеина и растварача. Тако добијени полипептидни ланци се одвајају према величини или наелектрисању.

Кидање дисулфидних мостова Кидање дисулфидних моства се врши: Оксидацијом пермрављом киселином при чему настају два еквивалентна цистеинске киселине. Редукцијом дисулфидних мостова 2-меркаптоетанолом. Након редукције се додају јодоацетат или 3-бромопропиламин, да не би дошло до рекомбинације -{С-С}- веза. Јодоацетат и 3-бромопропиламин модификују SH групе које више не могу да граде дисулфидне везе.

Анализа аминокиселинског састава Потребно је хидролизовати пептидне везе додатком јаке киселине или базе. Пошто су киселине мање деструктивне за аминокиселине (-{Ser, Thr, Arg}- и -{Cys}-), више се користе. Узорак протеина се раствара у -{6N HCl}- на 110 -{˚C}- у временском интервалу од 24, 48 и 72 сата. Аминокиселина триптофан се потпуно уништава у киселинама, а треонин и серин (које садрже -{OH}- групу у бочном ланцу) се полако уништавају. Хидрофобне аминокиселине, валин и изолеуцин, се опиру киселинској хидролизи.

Концентрација аспаргина и глутамина се не могу израчунати јер аспаргин прелази у аспаргинску киселину, а глутамин у глутаминску киселину.

Смеша хидролизованих аминокиселина се раздваја јоноизмењивачком хроматографијом или -{HPLC}--ом (). Одређује се концентрација сваке аминокиселине из смеше. Обе методе су потпуно аутоматизоване и део су инструмента који се назива анализатор аминокиселина (). Након анализе састава потребно је утврдити и редослед аминокиселина у полипептиду. Зато се одређују -{N-}- и -{C-}-терминални крајеви.

Идентификација -{N-}- и -{C-}- терминалних крајева Анализом -{N-}- и -{C-}-терминалних крајева одређујемо колико је пептидних ланаца присутно (један -{N-}- и -{C-}-крај значи да је присутан само један пептидни ланац). -{N-}-терминални крај се идентификује Едмановом деградацијом. Овом методом се одређује аминокиселинска секвенца, тако што се одваја по једна аминокиселина са -{N-}-краја и идентификује. Едманов реагенс (фенилизотицијанат, -{PITC}-) у слабо базном раствору, реагује са слободним аминокиселинским остатком на -{N-}-крају и настаје фенилтиокарбамил дериват (-{PTC}--протеин). Додатком трифлуроацетатне киселине формира се тиазолинонски дериват који се одваја од пептидног низа (пептидни низ је сада краћи за једну аминокиселину). Када се дода слаба киселина овај дериват постаје -{PTH}- (фенилтиохидантоин) који се идентификује хроматографски. За идентификацију -{HPLC-}-ом, сними се хроматограм свих стандардних аминокиселина са којима се пореде аминокиселине добијене Едмановом деградацијом. При Едмановој деградацији -{C-}-терминални крај се обично веже за нерастворан носач. Инструмент који се користи је Едманов секвенатор ().

C-терминални крај се идентификује коришћењем ензима карбоксипептидазе, која сече пептидне везе између две аминокиселине почевши од -{C-}-терминуса. Карбоксипептидаза -{A}- (из говеђег панкреаса) хидролизује све пептидне везе осим пролина, аргинина и лизина. Карбоксипептидаза -{B}- (из свињског панкреаса) хидролизује само аргинин и лизин, када су на -{C-}-крају, док су карбоксипептидазе -{C}- и -{Y}- ефикасне за све аминокиселине.

Фрагментација полипептидног ланца Фрагментацију полипептидног ланца могуће је извршити употребом протеолитичких ензима, који хидролизују специфичне пептидне везе. Најчешће коришћени ензими су трипсин и химотрипсин, који спадају у класу ендопептидаза (протеаза које хидролизују пептидне везе у полипептидном ланцу).

Трипсин хидролизује само пептидне везе које су на -{C-}-крају аминокиселина аргинин и лизин. На овај начин настају фрагменти који на C-крају имају -{Arg}- или -{Lys}-. Број фрагмената је једнак броју ове две аминокиселине плус 1 (-{C-}-терминални пептид протеина).

Химотрипсин хидролизује пептидне везе формиране између карбоксилних група ароматичних аминокиселина (фенилаланин, тирозин, триптофан). Пошто трипсин и химотрипсин хидролизују различите пептидне везе, делови насталих фрагмената ће се преклапати, тако да је могуће реконструисати аминокиселинску секвенцу. Могуће је користити и друге ензиме: клострипаин (хидролизује Arg резидуе), ендопептидаза -{Lys-C}- (хидролизује -{Lys}- резидуе), стафилококна протеаза (хидролизује -{Asp}- и -{Glu}- резидуе). За неспецифичну протеализу се користе: пепсин, папаин, термолизин, еластаза итд.

Реконструкција аминокиселинске секвенце Секвенце добијене фрагментацијом се пореде тако што се траже делови секвенце који се преклапају. На слици је приказана анализа секвенце протеина катроколастатина--{C}-. У реду са ознаком -{CAT-C}- је аминокиселинска секвенца (216 AK), добијена комбинацијом неколико метода. Ред са ознаком -{N-}-Терм показује секвенцу добијену Едмановом деградацијом у Едмановом секвенатору. Редови са ознакама M1-M5, показују секвенце добијене протеолитичким фрагментирањем цијаноген бромидом, а затим Едмановом деградцијом фрагмената M1-M5. Редови са ознакама K3-K6, показују секвенце добијене протеолитичким фрагментирањем ендопептидазом -{Lys-C}-, а затим Едмановом деградацијом фрагмената. Редови са ознакама E13-E15, су секвенце добијене протеолитичким фрагментирањем стафилококном протеазом, а затим Едмановом деградацијом фрагмената.

Одређивање позиције дисулфидних мостова Да би одредили положај дисулфидних веза потребно је користити протеин у коме су све везе очуване. Методом дијагоналне електрофорезе се фрагменти (повезани дисулфидним везама) могу изоловати.

Кораци при одређивању позиције дисулфидних мостова су: Смеша протеинских фрагмената се наноси на ивицу папира. Под утицајем електричног поља, фрагменти мигрирају према катоди. Исечени део се држи изнад раствора пермравље киселине да би -{С-С}- везе оксидисале. Папир се поново ставља у електрично поље, али се сада електрофореза ради у правцу нормалном на првобитни правац. Пептиди који нису имали дисулфидне везе не мигрирају (формирају дијагоналу), док фрагменти који су имали С-С везе мигрирају у односу на дијагоналу, могу се изоловати и идентификовати. Ана Поповић-Бијелић : Практикум из биофизичке хемије

Рекомбинантна ДНК и секвенцирање протеина

Аминокиселинска секвенца протеина може да се одреди и на основу секвенцирања одговарајућег сегмента у молекулу ДНК. Методе за секвенцирање ДНК су брже и једноставније од горе описаних метода за секвенцирање протеина. На овај начин је одређена секвенца за више од 106 остатака у више од 3000 протеина. Међутим, и поред тога је директно одређивање примарне структуре протеина незаменљиво из више разлога. Положај дисулфидних мостова се одређује једино секвенцирањем протеина. Многи протеини се модификују после биосинтезе. Ове модификације могу да се идентификују само директним секвенцирањем протеина. У неким случајевима није могуће издвојити фрагмент ДНК који садржи информације за секвенцу датог протеина.

Дакле, одређивање аминокиселинске секвенце протеина из секвенце база ДНК не може да замени директно одређивање примарне структуре протеина већ је комплементарно са њим.

Хемијске модификације протеина