Флуоресцеїн () — хімічна сполука ряду фталеїнів, синтетичний барвник помаранчевого кольору, що демонструє жовто-зелену флуоресценцію у розчинах.
Гарно розчиняється в органічних розчинниках, таких як спирт. У воді у присутності основ утворює добре розчинну аніонну форму.
У флуоресцентній спектроскопії використовується як стандарт при вимірюванні квантових виходів флуоресценції. Численні похідні флуоресцеїну застосовуються в біохімії та клітинній біології як флуоресцентні мітки.
Максимум спектра абсорбції — 494 нм, а емісії — 521 нм (у воді). Коефіцієнт екстинкції 92300 M−1см−1 (500 нм, основний етанол). Часто використовують похідні: ізотіоціанати (FITC) та 5(6)-карбоксифлуоресцеїн.
Колір водного розчину — жовтий «на просвіт» або зелений «збоку».
Фізичні властивості
Барвник має яскраву флуоресценцію (поглинання 494 нм / емісія 521 нм):
Квантовий вихід — 50—70 %. Час життя збудженого стану варіює між 3 нс (pH < 5) i 4 нс (pH > 9).
Флуоресцеїн має ізобестичну точку (однакове поглинання за різних значень pH) на 460 нм.
Отримання Вперше синтезовано Адольфом фон Баєром в 1871 році. Легко отримується сплавленням фталевого ангідриду з 1,3-дигідроксибензолом (резорцином) в присутності хлориду цинку:
Застосування CH3SO3H як каталізатора дає дещо кращі виходи й м'якші умови реакції.Sun, W. C.; Gee, K. R.; Klaubert, D. H.; Haugland, R. P., Synthesis of Fluorinated Fluoresceins. Journal of Organic Chemistry 1997, 62, (19), 6469-6475.Yuichiro Ueno; Jiao, G.-S.; Burgess, K., Preparation of 5- and 6-Carboxyfluorescein. Practical Synthetic Procedures 2004, 31, (15), 2591—2593.
Механізм Перший етап утворення барвнику — реакція Фріделя-Крафтса. При цьому кислотний каталізатор відщеплює протон, який приєднується до фталевого ангідриду, утворюючи карбокатіон — електрофіл, який заміщує водень в молекулі резорцину, повертаючи каталізатор. В молекулі збереглася карбонільна група, яка може знову бути протонована з утворенням карбокатіону.
Далі все проходить як спочатку, а протон потім приєднується до OH-групи залишку резорцину, каталізуючи його етерифікацію з іншим залишком резорцину. Утворюється сполука, яка біля центрального атома містить гідроксильну групу. Остання вступає у реакцію внутрішньомолелулярної естерифікації з утворенням лактону, який, завдяки таутомерії, частково перетворюється на забарвлену форму з хіноїдною будовою:
Похідні
Для мічення протеїнів використовують флуоресцеїн ізотіоціанат та активовані естери карбоксифлуорисцеїну. Багато інших барвників містять скелет флуоресцеїну і додаткові замісники (скажімо сульфогрупи), що підвищують розчинність та фотостабільність. Похідними флуоресцеїну є також барвники типу еозину.
Застосування
Спостереження за потоками води Одним з перших застосувань флуоресцеїну (у XIX ст.) було фарбування води в річках для відстеження напрямку потоку. Зараз подекуди застосовують для відстежень витоків трубопроводів.
Біологія У клітинній біології флуоресцеїн та його похідні — незамінний інструмент для флуоресцентної мікроскопії. Перевагою флуоресцеїну є те, що він ідеально підходить для збудження відносно доступним аргоновим лазером (488 нм). Недоліком барвників на основі флуоресцеїну є низька фотостабільність.
Див. також Похідні: Еозин
(FITC) (FAM) Еритрозин
— комерційні флуорофори на основі флуоресцеїну Pseudomonas aeruginosa, бактерія, яка виділяє флуоресцеїн , a biochemistry laboratory test
Примітки
Посилання Absorption and Emission Spectra of Fluorescein in Ethanol і Basic Ethanol на OGI School of Science and Engineering Fluorescein Ionization Equilibria на Invitrogen MSDS at Oxford University Absorption spectra and fluorescence emission spectra