Проце́синг, котранскрипці́йна модифіка́ція, посттранскрипці́йна модифіка́ція — дозрівання новосинтезованої молекули РНК до її функціонально активної форми.
Яскравим прикладом процесингу є дозрівання пре-мРНК до зрілої мРНК, із якої в цитоплазмі буде зчитуватися інформація про амінокислотну послідовність білків (трансляція). Утім, процесингу зазнають не лише мРНК, а й багато видів некодуючих РНК, транспортна РНК та рибосомна РНК.
У підручниках часто пишуть, що дозрівання пре-мРНК відбувається після її зчитування з ДНК матриці. Таке явище відповідає лабораторним умовам (in vitro), коли стадії процесингу мРНК вивчають поступово, незалежно одна від одної. Але за умов in vivo, у живих клітинах, процесинг мРНК відбувається безпосередньо під час транскрипції в складі РНК-полімеразного комплексу. Тому коректним терміном для мРНК дозрівання є котранскрипційна модифікація.
Проте не всі види РНК зазнають процесингу під час синтезу. Так, молекули тРНК дріжджів Saccharomyces cerevisiae дозрівають (зазнають сплайсингу) у цитоплазмі з подальшим експортом у ядро і поверненням до цитоплазми, тому в такому випадку коректним є термін «посттранскрипційна модифікація». Але у фаховій літературі частіше використовують термін «процесинг тРНК».
Процесинг мРНК
Процесинг пре-мРНК до зрілої мРНК відбувається безпосередньо в складі РНК-полімеразного комплексу в ядрі. Синтез мРНК виконує РНК-полімераза II. До її C-кінцевого домену приєднуються фактори, що діють на різних стадіях дозрівання транскрипту. Оскільки процесинг відбувається безпосередньо під час синтезу молекули РНК, а сплайсинг відбувається одразу після синтезу сплайс-сайтів, то пре-мРНК транскрипт для більшості генів багатоклітинних організмів можна назвати умовною теоретичною молекулою, яка не існує як така in vivo. Однак можливі варіанти сплайсингу поза РНК-полімеразним комплексом.
Загалом процесинг мРНК ділиться на зміну 3'- та 5'-кінцевих ділянок молекули (кепування та поліаденілування, відповідно) та сплайсинг (вирізання частин молекули РНК — інтронів). Модифікації 3'- та 5'-кінцевих ділянок молекули РНК, не лише мРНК, дуже важливі для стабільності РНК під час перебування в ядрі. «Відкриті» кінці РНК стають мішенями нуклеаз, таких як комплекс екзосома. Тому молекули РНК, які перебувають певний час у ядрі мають зміни на своїх 3'- та 5'-кінцевих ділянках.
Кепування
Кепування — це додавання кепу до пре-мРНК, що відбувається в декілька стадій за допомогою ферменту, що приєднує кеп (), та гуаніл-N7-метилтрансферази. Унаслідок цих реакцій на 5'-кінці мРНК формуються один чи два модифіковані нуклеотиди (найчастіше — метил-гуанідин), з'єднані з рештою мРНК незвичайним 5'-5' трифосфатним зв'язком.
Кепування виконує такі функції: захист мРНК від деградації нуклеазами; участь у подальшому процесингу, сплайсингу; експорт мРНК у цитоплазму; участь у трансляції.
Сплайсинг
Сплайсинг — це механізм, завдяки якому вирізаються інтрони — некодуючі ділянки пре-мРНК, тобто послідовності, які потім не будуть використані як матриця для біосинтезу білків. Зріла мРНК втрачає інтрони, залишаючи у своєму складі лише екзони. Сплайсинг відбувається за участі сплайсосоми, що містить малі ядерні РНК. У багатьох випадках пре-мРНК ще продовжує синтезуватися, тоді як інтрони вже вирізаються. Інтрон, що вирізається, має форму ласо (). Швидкість сплайсингу в евкаріот досить велика: у 10 % випадків у дріжджів сплайсосома може відрізати інтрон, коли полімераза знаходиться на відстані лише у 26-36 нуклеотидів, а 50 % сплайсингу завершується за 1,4 сек. після завершення синтезу 3'-кінцевого сплайс-сайту.
Альтернативний сплайсинг
У багатьох еукаріотів кількість білків, що можуть формуватись у клітинах, значно перевищує кількість генів, закодованих у ядрі. Так, згідно з результатами проєкту ENCODE (Енциклопедія елементів ДНК) 2012 року, у людини наявний 21 061 ген, що кодує білки, тоді як самих білків у клітинах людини — від 250 000 до мільйона. Різноманіття білків порівняно з кількістю генів досягається також завдяки явищу альтернативного сплайсингу.
При альтернативному сплайсингу з молекули пре-мРНК вирізаються різні комбінації інтронів, а перекомбіновані екзони зшиваються та формують різні зрілі мРНК. Таким чином, з одного гена можна отримати одну пре-мРНК, але багато видів зрілої мРНК і, відповідно, багато різних білків.
Гени пивних дріжджів Saccharomyces cerevisiae містять невелику кількість коротких інтронів, а в інших одноклітинних еукаріот, наприклад, трипаносом, найчастіше їх зовсім немає. Тому альтернативний сплайсинг в одноклітинних ядерних відбувається рідко.
Натомість у багатоклітинних еукаріотів альтернативний сплайсинг — дуже поширене явище. Так, у людини приблизно 95 % пре-мРНК підлягають цьому процесу. Варіанти мРНК, що утворилися з однієї пре-мРНК, називають сплайс-варіантами або мРНК-ізоформами, і часто вони бувають тканинно-специфічними (тобто один сплайс-варіант існує в одній тканині, другий — в іншій). У плодової мухи D. melanogaster альтернативний сплайсинг спричинює детермінацію статі, а один ген Dscam () кодує понад 38 000 різних варіантів мРНК і, відповідно, білків (кількість, що більша за число генів у цього виду мух).
Основними регуляторам вибору варіантів сплайсингу є сила сплайс-сайту, модифікації гістонових хвостів (див. ілюстрацію «Схематичне зображення котранскрипційного процесингу пре-мРНК до зрілої мРНК») та позиція нуклеосоми, взаємодія РНК з різними РНК-зв'язуючими білками тощо. Сила сплайс-сайту відповідає частоті впізнавання цього сайту сплайсосомою і включення даного екзону у всіх синтезованих мРНК — це так званий «конститутивний сплайсинг». У регуляції сплайсингу беруть участь білки регулятори сплайсингу (), такі як NOVA1Білок NOVA-1 людини в датабазі та PTBP1 ()Білок PTB людини в базі даних та гетерогенні ядерні рибонуклеопротеїни (гяРНП, )
Окрім участі альтернативного сплайсингу в нормальній життєдіяльності організму, це явище може призводити до хвороб.
Проте не всі транскрипти, згенеровані альтернативним сплайсингом, можуть кодувати білки чи виконувати інші функції.
Поліаденілування
Після відрізання () транскрипту від РНК-полімеразного комплексу до молекули пре-мРНК із додається хвіст із багатьох залишків аденіну, звідки походить і назва реакції. Сигнал поліаденілування (поліА- чи polyA-сигнал, іноді polyA-сайт), так само як і стартовий сигнал, закодований у гені, і, відповідно, зчитується РНК полімеразою II у пре-мРНК. PolyA-сигнал має 2 компоненти: послідовність із 6 нуклеотидів AAУАAA (Т у ДНК замінюється на У в РНК), та У- або Г/У-збагачена послідовність, що розміщується на відстані 20 нуклеотидів від першого сигналу. Білки CPSF () та CstF () розпізнають ці сигнали.
PolyA-полімераза синтезує хвіст довжиною в 100—200 аденінових нуклеотидів. Довжина polyA-хвоста варіює між різними видами. Так, у людини в середньому додається 250—300 аденінів, а у дріжджів — 70-80.
Поліаденілування відбувається одразу після розщеплення молекули РНК (червоні ножиці на схемі «Котранскрипційний процесинг пре-мРНК до зрілої мРНК»), тому сигнал для поліаденілування ще називають сигналом для розщеплення та поліаденілування ().
Поліаденілування виконує такі функції: Експортування мРНК з ядра; Стабільність мРНК, включаючи захист мРНК від деградації нуклеазами; Участь у трансляції; експресії генів. Довжина polyA хвоста має важливе значення для контролю кількості білків, що будуть синтезовані із цієї РНК. Також у 3'-нетрансльованій ділянці містяться сайти розпізнавання молекулами РНК інтерференційного механізму, такими як мікроРНК.
Альтернативне поліаденілування
Наприкінці першого десятиріччя XXI ст. стало можливим робити секвенування () цілих транскриптомів. Це дало можливість встановити, що багато генів людини мають більше одного polyA-сигналу, що призводить до формування різних 3'-кінців однієї пре-мРНК.
До 2011 року стало зрозуміло, що багато білок-кодуючих генів мають не один, а декілька сайтів поліаденілування, між якими відбувається вибір під час синтезу мРНК. У людини 50 % генів можуть кодувати різні транскрипти завдяки альтернативному поліаденілуванню.
У деяких випадках альтернативне поліаденілування призводить до зміни амінокислотної послідовності білків, тоді як в інших варіації виникають в 3'-некодуючій ділянці мРНК, а кодуюча послідовність залишається незмінною. При виборі сайту поліаденілування може трапитись вкорочення 3'-нетрансльованої ділянки молекули мРНК, що призведе до втрати регуляторних елементів для взаємодії з мікроРНК, тоді, найімовірніше, мРНК буде менше пригнічуватися, і відповідно, з неї синтезуватиметься більше білків.
Вибір polyA-сайту залежить від багатьох умов, таких як ріст клітини, її розвиток та диференціація, а також патологічні процеси, зокрема розвиток пухлин.
Прикладом альтернативного поліаденілування є ген важкого ланцюга імуноглобуліну IgM, білок якого проходить зміну від мембраннозв'язаної до вільної форми. Така зміна є результатом вибору одного із двох polyA-сайтів.
Альтернативне поліаденілування часто трапляється під час утворення нейронів, де за рахунок такого процесу сотні генів мають більші 3' нетрансльовані ділянки — такі гени отримали назву подовжених (). Основним білком, який призводить до формування довшого 3'-кінця у нейронів — РНК-зв'язуючий білок Elav (). У плодової мухи його активність залежить від промоторної ділянки генів. У подовжених генів РНК-полімераза II — фермент, що синтезує РНК — затримується на довший час на початкових стадіях транскрипції в порівнянні з іншими генами.
Цікавим є те, що альтернативне поліаденілування може впливати на розміщення білку, що зчитується з даної мРНК у клітині, хоча при цьому не змінюється просторове розміщення самої мРНК у цитоплазмі. Так мРНК CD47 у клітинних лініях людини може мати два варіанти 3'-нетрансльованої ділянки: коротшу і довшу. Білки CD47, які транслювались із мРНК з довшою 3'-нетрансльованою ділянкою, розміщувалися здебільшого біля поверхні клітин, а CD47-протеїни, які було синтезовано з коротшої форми мРНК, були знайдені в ендоплазматичному ретикулумі.
Відсутність поліаденілування, полі-A(-) мРНК гістонів типово не підлягають поліаденілуванню у всіх організмів, натомість мають специфічні структури на 3'-кінці (див. п «Процесинг мРНК гістонів»), які захищають їх від деградації нуклеазами. Але крім мРНК гістонів у клітинних лініях H9 та HeLa було знайдено мРНК, які можуть у деяких випадках не мати полі-A хвосту, такі як мРНК znf460 та sesn3
Регуляція процесингу мРНК Паузи, які робить РНК-полімераза II, модифікації її C-кінцевого домену (фосфорилювання), метилювання ДНК, позиція нуклеосоми, модифікації гістонових хвостів (їх метилювання, ацетилювання та деацетилювання), формування вторинних структур синтезованої РНК, модифікації нуклеотидів та редагування РНК — всі ці фактори, що, по-перше, можуть впливати один на одного, а по-друге регулюють процесинг, призводять до наявності чи відсутності кепу, вибору сайтів сплайсингу та polyA-сайтів для альтернативного сплайсингу та поліаденілування, відповідно. Таким чином ці зміни призводять до різноманіття мРНК та встановлюють долю транскрипту: чи буде мРНК одразу руйнуватися екзосомним комплексом у ядрі, чи буде експортована до цитоплазми і чи зможуть мікроРНК взаємодіяти з нею, пригнічуючи біосинтез білків та/або деградувати її в цитоплазмі.
Процесинг мРНК гістонів
Синтез і дозрівання мРНК гістонів, що складають нуклеосому (H2A, H2B, H3 та H4) і лінкерного гістону H1 відрізняється від процесингу інших еукаріотичних мРНК. По-перше синтез мРНК цих гістонів відбувається у строгій залежності від клітинного циклу — гени гістнонів експресуються на початку S-фази. При чому по завершенню S-фази або при припиненні з різних причин реплікації ДНК, мРНК цих гістонів швидко руйнується комплексом екзосоми.