Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР або ) — експериментальний метод молекулярної біології, спосіб значного збільшення малих концентрацій бажаних фрагментів ДНК в біологічному матеріалі (пробі). Крім простого збільшення числа копій ДНК (цей процес називається ампліфікацією), ПЛР дозволяє здійснювати безліч інших маніпуляцій з генетичним матеріалом (введення мутацій, зрощення фрагментів ДНК), і широко використовується в біологічній і медичній практиці. Наприклад, для клонування генів, введення мутацій, виділення нових генів, секвенування, для створення і визначення генетично модифікованих організмів, діагностики захворювань (спадкових, інфекційних), ідентифікації малих кількостей ДНК, встановлення батьківства.
Історія
Полімеразна ланцюгова реакція була відкрита Кері Маллісом. За це відкриття він був нагороджений Нобелівською премією з хімії в 1993 році, через сім років після того, як він і його колеги з корпорації Cetus запропонували його для практичного використання. Вперше метод був винайдений у 1983 році, під час роботи Малліса в компанії Cetus у місті Емерівіль (Каліфорнія), одній з перших біотехнологічних компаній. Його задачею було створення коротких ланцюжків ДНК для інших учених. Малліс писав, що ідея ПЛР прийшла йому, коли він вночі в своєму автомобілі їхав уздовж Каліфорнійського шосе 1. Він продумував новий шлях аналізу змін (мутацій) в ДНК, коли усвідомив, що замість цього він винайшов метод ампліфікації будь-якої ділянки ДНК за допомогою повторних циклів дублювання, які б здійснював фермент ДНК-полімераза. В журналі Scientific American Малліс підвів підсумок методу: «Починаючи з єдиної молекули ДНК, носія генетичної інформації, ПЛР може надати 100 мільярдів подібних молекул за кілька годин. Реакцію дуже легко провести, вона вимагає однієї пробірки, незначної кількості реагентів, та джерела тепла»Mullis KB. The unusual origin of the polymerase chain reaction. Sci Am 1990;262(4):56-61, 64-5..
Фермент ДНК-полімераза зустрічається природно в живих організмах. В живих клітинах він виконує функції реплікації ДНК протягом мітозу та мейозу. Полімераза працює, зв'язуючись з одним ланцюжком ДНК та синтезуючи інший, створюючи подвійну спіраль. У першому прототипі процесу ПЛР, фермент використовувався in vitro (у контрольованому оточенні за межами організму). Дволанцюгова молекула ДНК розділялася на окремі ланцюжки за допомогою нагрівання до 94 °C. Однак при цій температурі ДНК-полімераза, що використовувалася на той час денатурувалася, тому фермент доводилося додавати після стадії нагрівання на кожному циклі реакції. Оригінальна процедура була дуже неефективна, тому що вимагала багато часу, великих кількостей ДНК-полімерази і безперервної уваги протягом всього процесу.
Пізніше, цей оригінальний процес ПЛР був значно вдосконалений використанням ДНК-полімерази взятої з термофільних (теплолюбних) бактерій, що зазвичай ростуть в гейзерах за температури понад 110 °C. ДНК-полімераза, взята з цих організмів, стійка за високих температур, і при використанні у ПЛР не пошкоджується при нагріванні до необхідної температури. З тих пір необхідність додавати нову ДНК-полімеразу на кожному циклі зникла, процес копіювання ДНК був спрощений і автоматизований.
Одна з перших теплостійких ДНК-полімераз була отримана від бактерії Thermus aquaticus і стала відома під назвою «Taq». Taq-полімераза широко використовується для ПЛР і зараз. Проте, її недоліком є те, що через відсутність механізму корекції помилок у 3'→5' напрямку, вона робить відносно велику кількість помилок при копіюванні ДНК, що приводить до мутацій. Нові полімерази, такі як або Pfu, отримані з архей, мають необхідний механізм корекції і можуть значно скоротити число мутацій, які зустрічаються в відтворюваній послідовності ДНК. Проте, ці ферменти полімеризують ДНК набагато повільніше, ніж Taq. Зараз доступні комбінації Taq і Pfu, що забезпечують як високу процесивність (протяжність ділянки, що синтезується за одне зв'язування ферменту, і в результаті швидкість синтезу), так і високу точність копіювання ДНК.
ПЛР зараз може виконуватися на фрагментах ДНК розміром більше 10 kbp (тисяч пар основ), але середній розмір ділянки ДНК, що ампліфікується, — від кількох сотень до кількох тисяч пар основ ДНК. Проблема з довгими фрагментами — у великій кількості помилок та довгому часі реакції, тому необхідно підтримувати баланс між точністю і процесивністю ферменту. Зазвичай, чим довше ділянка, тим вища ймовірність помилок.
Метод ПЛР був запатентований корпорацією Cetus, де працював Малліс, невдовзі після його відкриття. Використання Taq-полімерази також було захищене патентами. Проте, відбулося кілька високопрофільних судових процесів щодо цього методу, зокрема невдалий судовий процес, ініційований компанією DuPont. Фармацевтична компанія Hoffmann-La Roche придбала права на патенти в 1992 році і зараз має всі права на ПЛР. Битва патентів на право використання ферменту Taq-полімерази все ще продовжується в кількох юрисдикціях у всьому світі між компаніями La Roche і Promega. Цікаво, що компаніям вдалося продовжити права на ПЛР і Taq на час після закінчення початкового патенту 28 березня 2005 року.Advice on How to Survive the Taq Wars ¶2 : GEN Genetic Engineering News Biobusiness Channel: Article. May 1 2006 (Vol. 26, No. 9).
Принцип дії
Необхідні компоненти
Метод заснований на багаторазовому вибірковому копіюванні певної ділянки ДНК за допомогою ферментів in vitro (в штучних умовах). При цьому відбувається копіювання тільки тієї ділянки, яка задовольняє задані умови, і лише в тому випадку, якщо він присутній в досліджуваному зразку.
За допомогою ПЛР зазвичай можуть бути ампліфіковані відносно короткі (до 10 kbp) ділянки ДНК з відомими кінцями, у окремих випадках можуть використовуватися ділянки до 40kbp. Для проведення найпростішої ПЛР потрібні такі компоненти: ДНК-матриця, тобто фрагмент ДНК, що містить ту ділянку, яку потрібно ампліфікувати. Два праймери, комплементарні кінцям необхідного фрагменту. Термостабільна ДНК-полімераза. Дезоксинуклеотидтрифосфати (A, G, C, T). Буферний розчин.
ПЛР проводять в ампліфікаторі — приладі, що забезпечує періодичну та швидку зміну температури (охолоджування і нагрівання) тестових пробірок із розчином, зазвичай з точністю не менше за 0,1 °C.
Праймери
Специфічність ПЛР базується на утворенні комплементарних комплексів між матрицею і праймерами (короткими синтетичними олігонуклеотидами довжиною 18—30 основ). Кожен з праймерів комплементарний одному з ланцюгів дволанцюгової матриці, обрамляючи початок і кінець ділянки, яка ампліфікується.
Після гібридизації матриці з праймером (відпалВідпал () — гібридизація фрагментів ДНК), останній служить затравкою для ДНК-полімерази при синтезі комплементарного ланцюжка матриці (див. нижче).
Найважливіша характеристика праймерів — температура плавлення (Tm) комплексу праймер-матриця. Вона визначається, як температура, за якої половина нуклеотидів праймера гібридизована із матрицею. Tm можна приблизно визначити за формулою , де nX — кількість нуклеотидів Х в праймері. Якщо праймер короткий і Tm мала, то праймер може виявитися частково комплементарним до інших ділянок матричної ДНК, що може призвести до появи неспецифічних продуктів. Верхня межа температури плавлення — оптимум дії полімерази, активність якої зазвичай падає при температурі, вищіїй за 80 °C. Тому ретельний дизайн праймерів — необхідна задача, яку слід провести перед тим, як починати ПЛР.
При виборі праймерів бажано дотримуватися наступних критеріїв: вміст GC ~ 40—60%; близькі Tm праймерів (відмінності не більш, ніж на 5 °C); відсутність неспецифічних вторинних структур — шпильокШпилька — внутрішньомолекулярна самокомплементарна структура і димерівДимери праймерів — міжмолекулярні структури, що утворюються праймерами один з одним або з самим собою; бажано, щоб на 3’-кінці був гуанін або цитозин.
Хід реакції
Зазвичай при проведенні ПЛР виконується 20—35 циклів, кожен з яких складається з трьох стадій (див малюнок 2): Дволанцюгову ДНК-матрицю нагрівають до 94—96 °C (або до 98 °C, якщо використовується особливо термостабільна полімераза) на 0,5—10 хв., щоб ланцюги ДНК розділилися. Ця стадія називається денатурацією — руйнуються водневі зв'язки між двома ланцюгами. Іноді перед першим циклом проводять попереднє прогрівання реакційної суміші протягом 2—5 хв. для повної денатурації матриці і праймерів. Коли ланцюги розійшлися, температуру знижують до 50-60°C, щоби праймери могли зв'язатися з одноланцюговою матрицею; відбувається гібридизація праймерів та матриці. Ця стадія називається відпалом (). Температура відпалу залежить від послідовності праймерів і зазвичай вибирається на 4—5°С нижче за їх температуру плавлення. Тривалість стадії — 0,5—2 хв. ДНК-полімераза реплікує матричний ланцюжок, використовуючи праймер як затравку. Це так звана стадія елонгації. Температура елонгації залежить від полімерази. Полімерази Taq і Pfu, що найчастіше використовуються, найактивніші за 72 °C. Час елонгації залежить як від типу ДНК-полімерази, так і від довжини фрагмента, який ампліфікують. Середня швидкість елонгації — 1000 пар основ за 1 хв. Після закінчення всіх циклів зазвичай проводять додаткову стадію фінальної елонгації, щоб добудувати всі одноланцюжкові фрагменти. Ця стадія триває 5—15 хв.
Методи ПЛР
Вкладена ПЛР () — застосовується для зменшення частки побічних продуктів реакції. Використовують дві пари праймерів і проводять дві послідовні реакції. Друга пара праймерів ампліфікує ділянку ДНК усередині продукту першої реакції.
Інвертована ПЛР () — використовується в тому випадку, якщо відома лише невелика ділянка усередині потрібної послідовності. Цей метод особливо корисний, коли потрібно визначити фланкуючі послідовності після вставки ДНК в геном. Для здійснення інвертованої ПЛР проводять ряд розрізів ДНК рестриктазами з подальшим лігуванням. В результаті відомі фрагменти утворюються на обох кінцях невідомої ділянки, після чого можна проводити звичайну ПЛР.
ПЛР із зворотною транскрипцією або ЗТ-ПЛР () — використовується для ампліфікації, виділення або ідентифікації відомої послідовності з бібліотеки РНК. Перед звичайною ПЛР проводять транскрипцію молекули РНК за допомогою зворотної транскриптази і отримують комплементарну ДНК (кДНК). Цим методом часто визначають, де і коли експресуються певні гени.
Асиметрична ПЛР () — проводиться тоді, коли потрібно ампліфікувати переважно один з ланцюжків початкової ДНК. Використовується в деяких методиках секвенування і гібридизаційного аналізу. ПЛР проводиться за класичним сценарієм, за винятком того, що один з праймерів береться у великому надлишку.
Кількісна ПЛР () — використовується для швидкого вимірювання кількості певної ДНК, кДНК або РНК у пробі. Цей метод зазвичай використовується «у реальному часі» (Кількісна ПЛР у реальному часі). При цьому застосовують флуоресцентно мічені реагенти для точного вимірювання кількості продукту реакції у міру його накопичення.
Touchdown ПЛР () — за допомогою цього методу зменшують вплив неспецифічної гібридизації праймерів на утворення продукту. Перші цикли проводять при температурі, вищій за температуру відпалу, потім кожні декілька циклів температуру знижують. За певної температури система пройде через смугу оптимальної специфічності праймерів до ДНК.
Метод молекулярних колоній (або «ПЛР в гелі», ) — поліакріламідний гель полімеризують зі всіма компонентами ПЛР на поверхні і проводять термоциклування. У точках, які містять ДНК, до якої підібрані праймери, відбувається ампліфікація з утворенням молекулярних колоній.
Геліказ-залежна ампліфікація () — подібна до звичайної ПЛР, але реакція проходить при постійній температурі. Для роз'єднання ланцюжків ДНК використовується геліказа замість теплової денатурації.
ПЛР із швидкою ампліфікацією кінців кДНК () — ампліфікація матричної РНК (мРНК) за допомогою відомого фрагмента усередині цієї молекули.