Większość cyklonu B była stosowana w niemieckich obozach zagłady jako tani i prosty w użyciu insektycyd do odwszawiania odzieży więźniów i zapobiegania w ten sposób epidemiom tyfusu. Partie cyklonu B stosowane do trucia ludzi, stanowiące w ogólnej masie produkcji tego środka tylko niewielki jego odsetek, były celowo pozbawiane zapachowego środka chemicznego, mającego chronić przed przypadkowymi zatruciami przy normalnym użyciu tego środka.
thumb|Zawartość puszki z cyklonem B
Po raz pierwszy cyklon B został użyty jako środek przeciw ludziom w obozie Buchenwald w styczniu lub lutym 1940. Przetestowano go na grupie 250 romskich dzieci pochodzących z Brna.
Obozem, w którym użycie cyklonu B było najbardziej rozpowszechnione, był KL Auschwitz. Po raz pierwszy, eksperymentalnie przeciw 600 radzieckim jeńcom wojennym i 250 Polakom, tego środka użyto tam 3 września 1941. Z zachowanej dokumentacji wynika, że do obozu dostarczono co najmniej 25 ton cyklonu B, z którego części użyto do zabijania w komorach gazowych. Gdyby przyjąć, za komendantem obozu Rudolfem Hössem, że do zabicia 1500 ludzi trzeba było użyć od 5 do 7 kg cyklonu B, oznaczałoby to, że do uśmiercania użyto go około 4000 kg. Jednak użyto go znacznie więcej, ponieważ podana przez niego norma odnosi się do optymalnych warunków pogody i wielkości transportów.