Przedstawiona scena thumb|upright|Studium do postaci Filipa thumb|upright|Studium do postaci Jakuba Starszego Obraz przedstawia moment, w którym Jezus ogłasza, iż jeden z apostołów go zdradzi. Jezus zasiada w centrum, milczy z pochyloną głową, jego ręce ciężko opadają na stół, jedną dłoń wyciąga w stronę chleba, drugą w stronę wina. Według relacji Giorgia Vasariego twarz Jezusa została niedokończona, gdyż zdaniem Leonarda niemożliwe jest oddanie na niej niebiańskiej boskości. Leonardo da Vinci zerwał ze średniowieczną tradycją, zgodnie z którą uczniowie Jezusa sztywno siedzieli przy stole.
Apostołowie zgrupowani są po trzech, jednocześnie każdy z nich inaczej reaguje na słowa Jezusa. W pierwszej grupie są Bartłomiej, Jakub Młodszy i Andrzej, wyraźnie zaskoczeni słowami nauczyciela. W drugiej grupie znajdują się Judasz, skonsternowany lub rozgniewany Piotr i łagodny Jan. Judasz kurczowo trzyma sakiewkę ze srebrnikami, jego twarz wyraża chciwość i chytrość. Jan wydaje się smutny i przygnębiony, jednak nie stawia pytań, gdyż wie, że to nie on zdradził Jezusa. Obok Piotra znajduje się nóż, którym obetnie ucho żołnierza podczas aresztowania Jezusa. Jan nie zadaje pytań, jego postać jest pogrążona w smutku i bierności.