Następną grupę apostołów tworzą Tomasz, Jakub Starszy i Filip. Jakub rozkłada ramiona. Filip przyciskając dłonie do piersi pyta się Jezusa, czy nie chodzi o niego. Inne interpretacje głoszą, że Filip swoim gestem oznajmia, że nie zawaha się obronić Jezusa lub że wyraża swoją niewinność. Tomasz ma bystrą twarz. Unosi palec, którym zbada rany zmartwychwstałego Jezusa. Według innej interpretacji Tomasz swoim palcem chce udowodnić bezsens oskarżenia o zdradę. Przerażony Jakub rozkłada szeroko ramiona i wpatruje się w chleb i wino. Ostatnią grupę tworzą dyskutujący Mateusz, Tadeusz i Szymon. Mateusz ma wyciągniętą rękę, swoim gestem chce coś uczynić, by ochronić Jezusa. Tadeusz wyraża powściągliwość, wykazuje się większą dojrzałością. Szymon zaś jest zdezorientowany.
Leonardo nieszablonowo namalował także postać Judasza, który na współczesnych malarzowi przedstawieniach tej sceny był z grupy apostołów wyizolowany, usadowiony samotnie gdzieś na krańcu obrazu, nierzadko odwrócony tyłem do widza. Dłonie postaci tworzą harmonijny rytm i wyrażają połączenie łańcuchowe stanów duszy. Według interpretacji Antoniny Vallentin Leonardo był o wiele lepszym psychologiem niż inni malarze renesansowi. Świadczyć ma o tym umieszczenie Judasza w sąsiedztwie św.