W puszczy można spotkać ok. 170 gatunków kręgowców. Ze względu na panujące warunki przyrodnicze w Puszczy Niepołomickiej zachowało się wiele gatunków zwierząt o charakterze reliktowym. Najciekawsze z nich: gadożer, puszczyk uralski, pustułka, kobuz, bocian czarny. Bogactwu gatunkowemu sprzyjają rozległe, różnorodne tereny leśne, liczne podmokłe i bagniste łąki, sąsiedztwo gór i otwarte doliny sprzyjające migracji zwierząt. Spośród dużych ssaków w puszczy możemy spotkać sarny, jelenie, dziki. Czasem pojawia się wilk szary czy łoś.
Północna część puszczy jest szczególnie bogata w płazy, w okresie godowym na 1 hektar może przypadać nawet 2500 osobników ropuch zielonych i szarych, żab moczarowej, trawnej i rzekotki.
Na terenie puszczy prowadzona jest normalna gospodarka leśna. Na obrazie satelitarnym tego obszaru widoczne są jej skutki: mozaika młodników, zrębów i nielicznych starodrzewi.