W 1943 roku zbudowano pierwszą serię 15 Misteli S1 i skierowano je do IV dywizjonu KG 101 celem przeszkolenia załóg. Szkolenia ze względu na nietypowe własności aerodynamiczne układu były bardzo trudne, dlatego też początkowo instruktorami kursu byli piloci oblatywacze. Dochodziło do licznych kraks i awarii. Dowództwo nie przejmowało się jednak tym i przygotowywało plan wykorzystania bojowych wersji tych maszyn pod kryptonimem Unternehmen Beethoven (Przedsięwzięcie Beethoven). Produkcją Misteli zajmowały się zakłady w Nordhausen, Dessau, Lipsku i Oranienburgu.
Pierwszy wariant bojowy Mistel 1 składał się z samolotu myśliwskiego Messerschmitt Bf 109F-4 i bombowca Junkers Ju 88A-4. Różnica z wersją Mistel S1 polegała na tym, że z przodu samolotu bomby zamiast oszklonej kabiny wstawiona była specjalna głowica bojowa w kształcie żądła z ładunkiem kumulacyjnym. Za nią natomiast umieszczony był ładunek wybuchowy o masie 1700 kg, na który składała się mieszanka heksogenu i trotylu (w proporcji 70% T4 i 30% TNT). W 1944 roku powstał drugi wariant bojowy Mistel 2, na bazie wersji szkolnej Mistel S2. Do jego zbudowania posłużyły nocne bombowce Junkers Ju 88G-1 i myśliwce Focke-Wulf Fw 190A-6 lub A-8.