Praca naukowa Pasteur stał się sławny dzięki odkryciu dwóch enancjomorficznych form krystalicznych kwasu winowego (1848) i pierwszy zaproponował hipotezę istnienia enancjomerów, czyli stereoizomerów, które mają się do siebie tak jak przedmiot i jego odbicie zwierciadlane, a jednocześnie są nienakładalne. Odkrycie to zainicjowało nowy dział chemii – stereochemię.
W okresie 1857–1868 poświęcił się badaniom procesów fermentacji. Wykazał, że wywołują go drobnoustroje. W wyniku tych badań opracował metodę konserwacji pożywienia poprzez obróbkę termiczną (proces też zwany jest od nazwiska uczonego pasteryzacją) oraz obalił teorię samorództwa drobnoustrojów.
Za najważniejsze osiągnięcie uznawane są jednak wyniki prac z zakresu bakteriologii i wirusologii, które uwieńczone zostały opracowaniem pierwszej szczepionki ochronnej dla ludzi (przeciw wściekliźnie). Badania nad nią prowadził w latach 1881–1885. Już w 1885 została ona z powodzeniem zastosowana u żywego człowieka.
Prace Pasteura stały się również wzorcowym przykładem łączenia badań podstawowych i stosowanych w chemii oraz w anatomii i w fizyce.