Jednocześnie od połowy XVI w. nasiliła się kolonizacja Mazur przez chłopów mazowieckich (powstało 87 nowych osad), którzy stawali się ewangelikami i wtapiali w miejscową społeczność. Napływała także ewangelicka szlachta polska m.in. z Pomorza, Mazowsza i Wielkopolski uciekając przed uciskiem kontrreformacji. Wśród właścicieli ziemskich zdecydowanie dominowała jednak szlachta pochodzenia niemieckiego.
Zasady powoływania i uposażania duchownych i nauczycieli ustalono najpierw w ordynacji krajowej z 1526, a następnie – w „Artykułach o wyborze i utrzymaniu proboszczów” z 1540. Mimo to sytuacja materialna pastorów, ich przygotowanie i poziom wykształcenia były niezadowalające, a chłopi niechętnie płacili podatki na ich utrzymanie.
Najazd Tatarów (sprzymierzonych z wojskiem polskim) na Mazury w 1656, spustoszył i wyludnił ten region oraz pogłębił niechęć mieszkańców do Polski (chociaż Tatarzy mordując i ograbiając Mazurów, działali wbrew rozkazom polskiego dowództwa). Oderwanie Prus Książęcych od Polski w 1657 (jako skutek potopu szwedzkiego) doprowadziło do umocnienia władzy księcia według absolutystycznego modelu brandenburskich Hohenzollernów. Książę Fryderyk Wilhelm całkowicie podporządkował sobie Kościół Pruski i ograniczył jego autonomię.