Z przełomu XVI i XVII w. oraz z II poł. XVII w. pochodzi polichromia w cerkwi unickiej. Odsłonięta w części na ścianie północnej przedstawia scenę Apokalipsy według św. Jana. Polichromia występująca na ścianach wschodniej i południowej przedstawia kuszenie Chrystusa.
W latach 1620–1638 z fundacji Tomasza i Katarzyny Zamoyskich na miejscu dawnego kościoła Świętej Trójcy wzniesiono kościół murowany, a przy nim klasztor.
Miasto pustoszone przez Kozaków (1648), Szwedów (1656) oraz Turków i Tatarów (1672).
W roku 1644 Tatarzy spalili kościół św. Mikołaja (pozostały same mury). W latach 1648–1649 Powstanie Chmielnickiego: spalenie synagogi. Wydarzenia te opisał i wydał drukiem w 1650 roku Meir ben Szmuel. W roku 1659 Jan Zamoyski zezwolił na wybudowanie nowej synagogi w miejscu zniszczonej świątyni. Została zbudowana w stylu renesansowym z fryzem arkadowym, nakryta łamanym dachem polskim. W roku 1668 nastąpiła konsekracja odbudowanego kościoła św. Mikołaja. W 1672 roku Jan Sobieski zawiązał tutaj konfederację wojsk koronnych, tzw. konfederację szczebrzeszyńską.
XVIII wiek W roku 1701 odbyła się sesja Sejmu Czterech Ziem (Waad). W 1765 roku w Szczebrzeszynie zamieszkiwało 444 Żydów. W 1783 roku klasztor św.