W okresie, gdy cerkiew w Szczebrzeszynie należała do unitów, została kilkakrotnie wyremontowana i przebudowana, przez co zatraciła cechy wschodniochrześcijańskiej architektury sakralnej. Na przełomie XVIII i XIX w. do wnętrza świątyni wstawiono wzorowane na łacińskich ołtarze główny i boczne, które usunięto w czasie przebudowy w latach 1867–1870.
Po wejściu w życie ukazu tolerancyjnego cara Mikołaja II zdecydowana większość wiernych parafii szczebrzeszyńskiej, zmuszonych wcześniej do przyjęcia prawosławia, przeszła do Kościoła rzymskokatolickiego. Cerkiew pozostała jednak czynna do 1915, tj. do momentu, gdy w mieście przebywali rosyjscy urzędnicy i wojskowi. Po odzyskaniu niepodległości przez Polskę nie została ponownie otwarta, gdyż w Szczebrzeszynie pozostały tylko dwie osoby wyznania prawosławnego. W 1938 znajdowała się na liście cerkwi przeznaczonych do zniszczenia w ramach akcji rewindykacyjno-polonizacyjnej, jednak po protestach mieszkańców jej rozbiórka została przerwana.