Podłoże stosowane jest do hodowli bakterii tlenowych lub fakultatywnych beztlenowców. Wzrastają na nim – podobnie jak na agarze krwawym – paciorkowce i gronkowce.
Agar czekoladowy jest najlepszym podłożem do hodowli Bartonella henselae (obok agaru z krwi króliczej) oraz Eikenella corrodens.
Wyniki odczytuje się zazwyczaj po 48 godzinach (18–24 w przypadku gonokoków).
Krew Agar czekoladowy jest rutynowo wykorzystywany podczas posiewu krwi przy podejrzeniu bakteriemii lub infekcyjnego zapalenia wsierdzia.
Płyn mózgowo-rdzeniowy Przy podejrzeniu zapalenia opon-mózgowo rdzeniowych należy bezwzględnie wykonać posiew na agarze czekoladowym, ponieważ dwoinka zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych nie wzrasta na innych podłożach.
Plwocina Agar czekoladowy z bacytracyną jest używany przy posiewie plwociny.
Żółć Rutynowe posiewy żółci na agar czekoladowy nie są zalecane, chyba że preparat bezpośredni będzie charakterystyczny dla Haemophilus.
Mocz 0,27% przypadków zakażeń układu moczowego jest spowodowane przez Haemophilus, natomiast w podgrupie dzieci wskaźnik ten wzrasta do 0,88%.