Paleobiologia Thylacosmilus był jednym z największych drapieżników swoich czasów na kontynencie południowoamerykańskim. Prowadził prawdopodobnie samotniczy tryb życia, mimo to zapewne był w stanie zabić celnym ukąszeniem rozrywającym gardło większość występujących tam zwierząt roślinożernych, takich jak makrauchenia czy Telicomys. Dyskusyjne pozostaje jednak, w jaki dokładnie sposób zabijał swoje ofiary. Większość autorów twierdzi, że polował z zasadzki, choć niewykluczone, że był w stanie gonić ofiary na dłuższych dystansach. Nie potrafił jednak szybko biegać. Thylacosmilus mógł bardzo szeroko rozwierać szczęki, jednak siła jego ugryzienia była stosunkowo bardzo mała, co sugeruje, że mięśnie szczęk odgrywały bardzo niewielką rolę przy obezwładnianiu ofiary. Ponadto kły byłyby wówczas narażone na złamanie. Do obezwładnienia ofiar służyły prawdopodobnie silnie umięśnione kończyny przednie zakończone niewciągalnymi pazurami. Przypuszczalnie jego środowiskiem życia były tereny stepowe porośnięte wysoką trawą. Thylacosmilus prowadził naziemny tryb życia, w przeciwieństwie do licznych Sparassodonta, które wspinały się na drzewa.