W 1940 roku Eleanor odradzała mężowi kandydowanie po raz trzeci na prezydenta, jednak wybuch II wojny światowej zmienił jej nastawienie – osobiście pojechała na konwencję do Chicago, by agitować na rzecz prezydenta. Po trzecim z rzędu zwycięstwie Roosevelta pierwsza dama została zastępcą dyrektora Urzędu Obrony Cywilnej. Jej zadaniem była budowa szpitali, schronów, domów i ośrodków rekreacyjnych. Z powodu ostrej krytyki konserwatystów pierwsza dama ustąpiła ze stanowiska, a wkrótce potem urząd rozwiązano. Mimo to nadal włączała się w akcje na rzecz zniesienia dyskryminacji rasowej i wizytowała bazy wojskowe, m.in. na Karaibach i Ameryce Środkowej. Gdy zbliżał się koniec wojny, popierała męża w sprawie ustaleń konferencji jałtańskiej.
12 kwietnia 1945 roku zmarł Franklin Delano Roosevelt, przebywając w towarzystwie dawnej konkubiny Lucy Mercer Rutherford. Pierwsza dama dowiedziała się, że Mercer bywała w Białym Domu na zaproszenie córki Rooseveltów, Anny. Od tego czasu stosunki pomiędzy Eleanor i Anną były napięte.