Cerkiew w Tarnogrodzie z pewnością pozostawała przy prawosławiu przez kilkanaście lat po unii brzeskiej, tj. do śmierci biskupa przemyskiego Michała Kopysteńskiego, który aktu unijnego nie podpisał. Po śmierci hierarchy przywilej na katedrę przemyską otrzymał unita Aleksander Oleksowicz Krupecki, podczas gdy prawosławna szlachta domagała się mianowania ordynariuszem Jana Chłopeckiego, który zachowywał wyznanie prawosławne. Rywalizacja o zarząd eparchii trwała w latach 1610–1652, w okresie tym poszczególne parafie same decydowały o tym, którego biskupa pragną uważać za swojego zwierzchnika. Zachowane dokumenty z 1652 pozwalają domniemywać, że najpóźniej w tym roku cerkiew tarnogrodzka przyłączyła się do Kościoła unickiego. Mimo to w 1694 Tarnogród został wymieniony jako siedziba jednego z dekanatów prawosławnej eparchii przemyskiej. Według Mariana Bendzy miejscowa parafia uznawała tę jurysdykcję do 1772, zaś unię przyjęła w 1773.
Cerkiew tarnogrodzka była świątynią drewnianą. Opis z 1763 informuje, iż posiadała jedną kopułę i pięć ołtarzy, poświęconych Deesis, Chrystusowi Zbawicielowi, Trójcy Świętej, Najświętszej Maryi Pannie oraz św. Mikołajowi.