Mechanizm działania Mechanizm działania mitotanu nie jest w pełni wyjaśniony. Badania na zwierzętach wskazują, że lek działa bezpośrednio cytotoksycznie na komórki kory nadnercza poprzez toksyczny wpływ na mitochondria. Działanie to jest selektywne, postępujące i dotyczy wyłącznie warstwy siatkowatej i pasmowatej kory nadnercza, które odpowiadają za produkcję glikokortykosteroidów. Mitotan nie wpływa na warstwę kłębkową, produkującą aldosteron. Mitotan hamuje syntezę kortyzolu poprzez rozrywanie łańcucha cholesterolu, który jest prekursorem wszystkich hormonów steroidowych, oraz 11-β-hydroksylację – etap niezbędny podczas syntezy steroidów. Jest inhibitorem dehydrogenazy G-6-P, hamując tym samym syntezę fosfopirydyny w nadnerczach oraz jej metabolizm. Najprawdopodobniej mitotan wpływa również na obwodowy metabolizm steroidów. Wywiera również wpływ na białka wiążące kortykosteroidy oraz hormony płciowe, zwiększając ich stężenie we krwi. Mitotan jest również silnym inhibitorem P-glikoproteiny.
thumb|250px|Białko wiążące kortykosteroidy (na ilustracji związane z ligandem – hydrokortyzonem). thumb|250px|Białko wiążące hormony płciowe (na ilustracji związane z ligandem – dihydrotestosteronem).