Budowa murów świątyni trwała ostatecznie do ok. 1590 roku, a wnętrza wyposażono do 1602 roku. W 1593 roku przy kaplicy mieszkał proboszczPotwierdza to wizytacja diecezjalna z 1596 roku., a w 1596 roku zanotowano, że posiadała dach pokryty dachówką ceramiczną i była otoczona płotem. Stwierdzono, że szpital niegdyś tu istniejący, władze miejskie przeniosły wraz z uposażeniem do innej części miasta, zaś wszystkie dobra (domy, place, ogrody) zarówno szpitalne, jak i prepozyckie zajmują mieszczanie, płacąc z nich czynsz szpitalowi św. Stanisława.
Gdy w 1615 roku do Bydgoszczy sprowadził się zakon Klarysek, zdecydowano o ulokowaniu sióstr w miejscu przytułku dla ubogich na Przedmieściu Gdańskim. Na miejscu istniejących zabudowań w latach 1615–1618 wybudowano klasztor (część południową), połączony z kościołem krużgankiem. W 1619 roku w obecności biskupa włocławskiego Pawła Wołuckiego rada miejska zrzekła się prawa patronatu do kaplicy św. Ducha, kościoła klasztornego oraz wszystkiego, co należy do klasztoru na rzecz biskupa.