odbył jednocześnie uzupełniające studia na tej uczelni, uwieńczone doktoratem w 1867 na podstawie pracy Guenter Zainer i Świętopełk Fiol. W latach 1865–1868 kierował w Szkole Głównej Warszawskiej Katedrą Bibliografii. Powrócił do Krakowa w 1868 i został dyrektorem Biblioteki Jagiellońskiej (a w 1870 profesorem zwyczajnym UJ); pełnił tę funkcję do 1905, gdy ustąpił. Był jednym ze współtwórców Akademii Umiejętności (przyszłej PAU) i jej członkiem czynnym od 1872; dla potrzeb Akademii pozyskał środki finansowe (fundusz Wereszczyńskiego, stypendia Szklarskiego) oraz zapis dóbr Szczawnicy. Był sekretarzem (1872–1878) i dyrektorem (1877–1890) Wydziału I AU, a w latach 1873–1888 przewodniczącym Komisji Bibliograficznej AU. Ponadto należał do Towarzystwa Naukowego Krakowskiego (od 1861) oraz Poznańskiego Towarzystwa Przyjaciół Nauk (1889 członek honorowy).
Jako uczony Karol Estreicher zasłużył się przede wszystkim opracowaniem niemal kompletnej bibliografii druków polskich, wydanych w Polsce i za granicą oraz dotyczących Polski, obejmującej lata 1470–1889;