W okresie opriczniny monaster był miejscem przetrzymywania przeciwników politycznych władz. Nad grobem jednego z nich, księcia Władimira Worotyńskiego, za pieniądze zesłańców powstała cerkiew św. Włodzimierza. Wydarzenie to stało się przyczyną czasowego pogorszenia relacji między Iwan Groźnym a monasterem.
W latach 30. XVI w., wobec znacznego rozwoju monasteru, podzielił się on na dwie sąsiadujące ze sobą wspólnoty. W końcu tegoż stulecia klasztor był nie tylko centrum życia duchowego, ale i twierdzą, ufortyfikowaną murami z ośmioma basztami. W latach 1612–1614 monaster był trzykrotnie atakowany przez polski oddział płk Piesockiego, który jednak nie zdołał go zdobyć. W 1654 wokół klasztoru wzniesiono nowe mury obronne. Zbudowano również nowe obiekty: cerkiew św. Epifaniusza Cypryjskiego (1645) oraz budynek szpitalny z cerkwią św. Eutymiusza Wielkiego (1643–1646), kamienny budynek z celami oraz dom przełożonego. Ze względu na swoje znaczenie monaster był określany jako „północna ławra”. W 1648, zgodnie z postanowieniem cara Aleksego I, w klasztorze ukrywał się jego dawny wychowawca, polityk Boris Morozow, którego car pragnął uchronić przed przywódcami Buntu Solnego. Po zmianie sytuacji politycznej, gdy Morozow mógł opuścić klasztor, on sam, jak i car sfinansowali budowę nowych murów obronnych.