Wstępną gotowość bojową pułk osiągnął w połowie 1942 roku, jednak pierwsza akcja bojowa samolotów miała miejsce 23 czerwca 1943 roku (według niektórych źródeł miało to miejsce 20 czerwca). Dziewiętnaście Ki-49 (według niektórych źródeł 18), 6 Ki-21 i 9 Ki-48 w eskorcie dwudziestu dwóch myśliwców Ki-43 zaatakowało Port Darwin w Australii. Debiut bojowy zakończył się utratą dwóch maszyn nad celem, zestrzelonych przez australijskie Supermarine Spitfire. Trzy maszyny rozbiły się, lądując przymusowo na Timorze. Kolejne dwie odniosły uszkodzenia, ale po dokonanych naprawach wróciły do służby.
We wrześniu 1943 roku samoloty pułku brały udział w akcji odpierania alianckiego desantu pod Lae. Straty były na tyle duże, iż pułk wycofano z linii celem reorganizacji i przezbrojenia w nową wersję Ki-49. Drugą i ostatnią jednostką przezbrojoną w pierwszą wersję Ki-49 był 74 Pułk Bombowców Ciężkich stacjonujący w Mandżukuo, który nowe samoloty otrzymał pod koniec 1942 roku jednak z braku celów na terenie stacjonowania pułku, bombowce jednostki nie brały udziału w walkach.