W celu zachowania wierności historycznej obecni w poprzednich odsłonach strażnicy, reagujący nawet na drobne przewinienia gracza, zastąpieni zostali policjantami, podejmującymi działania dopiero wtedy, kiedy postać w ich obecności dopuści się poważnego przestępstwa, a zamiast przejmować bezpośrednio kwatery templariuszy, postacie przejmują kwatery wspierającego ich gangu znanego jako „Nędznicy”.
W grze możliwe jest wcielenie się w dwie postacie: bliźnięta Jacoba i Evie Frye’ów. Jacob jest narwanym osiłkiem specjalizującym się w bezpośrednich starciach, podczas gdy Evie preferuje skradanie się i bardziej taktyczne podejścia. Evie jest także pierwszą grywalną postacią kobiecą w głównej odsłonie cyklu Assassin’s Creed. W odróżnieniu od poprzednich części, w których postacie korzystały z mieczy i broni drzewcowej, w Syndicate pojawiają się bronie bardziej pasujące do epoki – jak kastety, małe rewolwery, laski z ukrytym ostrzem czy nepalskie noże kukri – które można ulepszać, żeby poprawić ich osiągi w walce. Bliźnięta mogą też nałożyć różne elementy odzienia zapewniające zróżnicowane statystyki, jak również ulepszać je bezpośrednio bądź poprzez nabycie odpowiedniej umiejętności w drzewku rozwoju. W miarę postępów w grze postacie zdobywają punkty doświadczenia.