W szpitalu pracowało wielu wybitnych lekarzy różnych specjalności, m.in. Jan Krotoski, Teofil Kucharski, Jan Szmurło, Adam Wrzosek. Od roku 1940 do wybuchu powstania (1 sierpnia 1944) komendantem szpitala był płk dr med. Leon Strehl, szef sanitarny Komendy Głównej AK.
Do stycznia 1945 W latach okupacji niemieckiej (1939–1945) wielu wykładowców i absolwentów Szkoły Podchorążych Sanitarnych w Ujazdowie walczyło w szeregach Armii Krajowej.
1 sierpnia 1944 roku Leon Strehl przeszedł do Szpitala Maltańskiego, przekazując stanowisko komendanta ppłk prof. Teofilowi Kucharskiemu.
W piątym dniu powstania (5 sierpnia 1944) okolicę opanowali Niemcy. Podpalili sąsiednie budynki i zażądali natychmiastowej ewakuacji szpitala. Uformowano kolumnę transportową, złożoną z 1491 osób ze Szpitala Ujazdowskiego, 340 osób ze szpitala św. Ducha oraz z 5 wozów z instrumentami medycznymi, lekami, żywnością, opatrunkami i kasą szpitalną (część zapasów Niemcy przejęli na trasie). Ciężko rannych niesiono na noszach i łóżkach.
Kolumna wyruszyła rano 6 sierpnia, pod flagami Czerwonego Krzyża (Niemcy dołączyli do niej 350 kobiet, przetrzymywanych jako zakładniczki w gmachu Sejmu).